蛋白酶活力测定

Δ
H2O 50ml
混匀 + 溴水 15`
Δ
冷却 →黄色 → 过滤
金黄色溶液
(1)柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液 pH=3.0
A液：0.1mol/L柠檬酸 21.01g C6H8O7·H2O → 1000ml
CH2—COOH HO—C —COOH
CH2—COOH
B液：0.1mol/L柠檬酸纳 29.4g Na3C6H5O7·2H2O → 1000ml
胶原蛋白（80%-85%）
弹性蛋白 非胶原蛋白 网硬蛋白
间质蛋白
酶的活力会下降 酶的催化能力强
测定方法
乙醇滴定法、甲醛滴定法等
Folin-酚法，紫外分光光度法，残 氮量测定法等等。
Gross法、明胶粘度下降法、凝乳 作用法
酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋 白酶原激活作用的大小来表示。
二、测定原理
福林试剂，在碱性情况下极 不稳定。可被酚类化合物还原， 而呈蓝色反应。由于蛋白质或 水解产物中含有酚基的氨基酸 (酪氨酸、色氨酸等)也呈这个 反应，因此可以利用这个原理 来测定蛋白酶活性的强弱。
蛋白酶的活力定义：
在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶
液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白） 所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。
表示为：单位/g或单位/ml。通常人
们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为
5万单位，即：50000μg/g =0.05g酪氨酸 /1g酶粉。
生皮蛋白 质
测定意义
➢ 缓冲溶液
➢ 福林试剂
显色剂
一种杂多酸
磷钼酸 H3[P（Mo3O10）4] 磷钨酸 H3[P（W3O10）4]
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O Na2MoO4·2H2o
H2O 85﹪H3PO4 浓HCL
100g 25g 100ml 50ml 100ml
Li2 SO4 50g 回流 10hr +
基酸、肽；
（1）作用有专一性、选择性
（2）催化速度快 （3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质
在激烈振荡、加热、 紫外线、X-射线的照 射，重金属盐作用下， 它的二、三结构会发 生改变。而变性，失 去催化能力这种现象
叫做酶的失活
底物浓度 pH 温度 时间
底物浓度
V Vmax
底物浓度C C0
饱和浓度
B液：0.2mol/L Na2HPO4溶液 71.7g Na2HPO4·12H2O → 1000ml
① pH=7.2的磷酸盐缓冲溶液
A液 28ml B液 72ml
H2O 1000ml
② pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液
蛋白酶活力测定
一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作手续 五、计算 六、注意事项
一、概述
1．什么是酶？ 2．影响酶催化反应的
因素 3．什么是酶的活力? 4．测定意义 5. 测定方法
生物催化剂
一种酶只作用一种底 物：
淀粉酶：只能催
特殊催化功能的蛋白质
化淀粉水解 低聚糖；
→
糊精、
酶的特性:
蛋白酶：只能催 化蛋白质水解 → 氨
定
1398：T最适 ：30℃-37℃（pH：6.0-
6.5 ）
T最适 ：40℃-50℃（pH：7.0-
7.5 ）
2709：T最适 ：45℃-55℃ 40℃以下 稳定。
作用时间的影响
Q（反应物的消A 耗量或dQ生成物K 的生成量)
dt dQ
v dt
o
t0
t
结论
酶催化反应 在反应初速度时间内 最适温度 最适pH 饱合底物浓度 在最大活力处比较
成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温 度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋 酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤， 移取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入 福林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比 较，计算出被测酶制剂的活力。
三、试剂
➢ 10﹪ CL3CCOOH 水溶液
➢ 0.55mol/L碳酸钠溶液
显色剂
亮金黄色
福林试剂→
3．朗伯-比尔定律及其应用
E —— 吸光度 A —— 消光值 OD —— 光密度
有色真溶液
E = K·Ｃ·L
入射光强度I0 C
= lg（I0/I）
L
= K′·C
透过光强度I
透光率 T = I I0
朗伯-比尔定律的应用
[X] → [RX] → OD
OD=K·C[RX]
被测组分的浓度与光密度OD成直线关系
用时：A∶B=18.6∶1.4混合
柠檬酸—柠檬酸钠溶液的pH计算
弱酸—弱酸盐缓冲体系
pH = pka1+lg（C酸/C盐） = 3.13+ lg（C酸/C盐）
柠檬酸:
pKa1 = 3.13 pKa2 = 4.76 pKa3 = 6.40
（2）0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液
A液：0.2mol/L NaH2PO4溶液 31.2g NaH2PO4·2H2O → 1000ml
例子： 1398 0.5%酪蛋白 40℃
7.5 10min
例子： 2709 0.5%酪蛋白 40℃
10
10min
2.显色反应
钼蓝+钨蓝
蓝色物质
福林试剂 + 酪氨酸 OH-
HO — —CH2—CH—COOH
还原性 NH2
Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 HCL
Li2SO4 Br2
显色剂
溶液pH的影响
OD
pH pH最适
酶的分类
❖ 酸性蛋白酶
3350 pH最适=2～4； 7401 ❖ 中性蛋白酶
pH最适=3.0
1398 pH最适=7～7.5； 166 ❖ 碱性蛋白酶
pH最适=7～8
2709 pH最适=9～11； 209 pH最适=9.5～11
温度的影响
OD
T最适
T（℃）
3350：T最适 ：45℃-47℃ 40℃以下稳
[X]
OD
OD= K′·C[X]
注 意:
①选择λmax
λmax =680nm
②OD值的范围 OD=0.2～0.6 OD=0.43
4．制作标准曲线
酪氨酸浓度C OD
C1
OD1
C2
OD2
C3
OD3
···
···
Cn
ODn
福林—酚法测定蛋白酶活力 方法要点
配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定
条件下（T、pH、t）与福林试剂显色后，测定 光密度OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配
1．酶催化反应
酶催化
酪蛋白
酪氨酸
条件
条件： 选择： 措施：
底物浓度
C0 C≥ C0
白无在温T味色弱最度适，至酸溶黄中
色 于 沉
稀粉碱沫pH、，浓无酸臭， 淀 ，pH几最适乎 不
Hale Waihona Puke 时间t0溶恒温于水水浴，有吸缓湿冲性溶，液干 t= t0
燥时稳定，潮湿时迅速
例子： 537 0.5%酪变蛋质白。 40℃
3.0 10min