转录组

三、实验思路
选取实验材料 ↓ RNA提取及分离mRNA ↓ mRNA片段化及cDNA片段合成 ↓ cDNA文库的制备与检测 ↓ 测序分析（RNA-Seq） ↓ 序列分析 ↓ 基因功能注释及分类 ↓ 基因表达分析
文献
• • • • • • • • • • • 转录组与RNA-Seq技术—张春兰 转录组研究新技术RNA-Seq及其应用—祁云霞 芝麻发育转录组分析—魏利斌 非模式生物转录组研究—刘红亮 低温胁迫下枇杷幼果转录组的De-novo组装和功能注释—杨伟 柑橘大实蝇转录组测序和滞育相关基因克隆研究—王刘豪 基于RNA-Seq技术的国产沉香转录组测序及数字基因表达谱分析— 吴宏清 基于RNA-Seq技术的米曲霉RIB40转录组学研究 基于高通量RNA测序的大鼠转录组注释研究—赵琛 转录组测序技术在玉米中的应用研究进展—许波 马氏珠母贝外套膜和珍珠囊的转录组测序及矿化基因的表达研究—于 呈呈
二、转录组学的研究方法
• 基于测序：全长cDNA文库、EST文库、 SAGE、MPSS • 基于杂交：cDNA芯片技术、寡聚核昔 酸芯片 • 基于第二代测序技术：转录组测序 （RNA-Seq）
三种转录组研究方法的比较
1.表达序列标签测序（EΒιβλιοθήκη BaiduT）
• （1）原理
EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5‘端和3’端单向 一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因 的一小部分，平均长度360±120bp。EST来源于一定环 境下一个组织mRNA所构建的cDNA文库，因此也能说明 该组织各基因的表达水平。
• （2）操作流程
组织样品mRNA的提取→逆转录合成cDNA →构建cDNA 文库→测序
2.基因表达系列分析（SAGE）
• （1）原理
SAGE是通过快速和详细分析成千万个EST来寻找出表达丰富度不 同的SAGE标签序列。此方法中，通过限制性酶切可产生非常短的 cDNA标签，并通过PCR扩增和链接，随后对连接体进行测序。
• （1）原理 把高通量测序技术应用到由 mRNA 逆转录生成的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的mRNA 片段在 特定样本中的含量，这就是mRNA-Seq，同样原理， 各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量 检测，统称作RNA-Seq。该技术首先将细胞中的所 有转录产物反转录为 cDNA 文库， 然后将 cDNA 文 库中的 DNA 随机剪切为小片段(或先将 RNA 片段化 后再反转录)，所得序列通过比对(有参考基因组)或从 头组装 (无参考基因组)形成全基因组范围的转录谱。
4.全长cDNA文库构建
• （1）原理
用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所 合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中 获得cDNA文库。
• （2）操作流程
a. mRNA的提纯 b. cDNA第一条链的合成 c. cDNA第二条链的合成 d. 双链cDNA的修饰 e. 双链cDNA的分子克隆 f. cDNA文库的扩增 e. cDNA文库鉴定评价
3.特征序列的大规模平行测序（MPSS）
• （1）原理
MPSS是以DNA测序为基础的大规模高通量基因分析新技术，通 过标签库的建立、微珠与标签的连接、酶切连接反应和生物信息分析 等步骤，获得基因表达序列。
• （2）操作流程
a.以寡核苷酸引物oligo-dT,来自细胞或组织的mRNA为模板合成为 cDNA双链。 b.限制性内切酶消化cDNA片段，纯化消化的cDNA片段。 c.将纯化的cDNA片段重组到含有标签序列的载体中，并通过标签上的 PCR引物扩增插入片段。酶切PCR产物，生成含cDNA片段与标签相 连接的产物。将cDNA模板连接到微球体上 d. cDNA序列测定
（2）操作流程
a.样品RNA准备 b.测序文库构建 用oligo dT纯化mRNA mRNA片段化处理 反转录反应合成双链cDNA 双链cDNA末端修复及3’端加A 用特定测序接头连接DNA片段两端 高保真聚合酶扩增构建成功的测序 文库 c.DNA成簇（Cluster）扩增 d.高通量测序 e.数据分析 原始数据读取 与数据库比对并进行注释 深层次数据分析
5.基因芯片技术
• （1）原理
该技术将大量探针分子固定于支持物上后与标记样品分 子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而 获取样品分子的数量和序列信息。包括点阵基因芯片和原 位合成基因芯片。
• （2）操作流程
芯片制备→样品制备→杂交反应→信号检测和结果分析
6.转录组测序 (RNA-seq)
四、后期计划
• 继续阅读文献清理之前阅读过程中的疑点、 发现盲点，全面了解转录组研究相关内容。 • 拿出更加清晰、具体的实验思路。 • 有计划地开始进行实验操作，掌握基本操 作技能，为以后做准备。 • 学习上认真准备期末考试。
Thank you
（3）RNA-Seq测序平台
几种测序平台的比较
（4）RNA-Seq技术应用
a.转录本结构研究 b.转录本变异研究 c.非编码区域功能研究 d.基因表达水平研究 e.低丰度全新转录本的确定
（5）RNA-Seq技术优势
• 相对于传统的Sanger测序法，RNA-seq具有以下优 势： • 1.数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核 酸分辨率的精确度高，同时不存在传统微阵列杂交的 荧光信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 • 2.高灵敏度：能检测到细胞中少至几个拷贝的西游转 录本。 • 3.任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探 针，因此无需了解物种基因信息，能直接对任何物种 进行转录组分析。同时能检测未知基因，发现新转录 本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP,UTR区域。
转录组研究与 RNA-Seq技术
汇报人：沈自慧 汇报日期：2014年12月1日
汇报内容
一、转录组定义及其 研究内容 二、转录组学的研究 方法 三、实验思路 四、后期计划
一、转录组定义及其研究内容
• 转录组：特定组织或细胞在某一发育阶段或功能 状态下转录出来的所有RNA的集合。 • 转录组研究内容 • 对特定细胞转录与加工的研究 • 对转录物编制目录 • 绘制动态转录物图形 • 转录物的网络式调节
（6）RNA-Seq发展前景
由于RNA-Seq相对于传统的测序方法具有明 显优势，所以被广泛运用到差异基因表达分析， 新转录本发现，可变剪切研究等方面。并且随着 技术的进步，成本的降低，其应用也越来越广泛。 近年来，由RNA-Seq技术测序而发表的文章越来 越多，而且对测序结果进行分析的软件也越来越 丰富，相信在不久的将来， RNA-Seq技术能够 获得相当大的普及。
• （2）操作流程
a.以dT为引物反转录合成cDNA，以锚定酶酶切。 b.将cDNA等分为A、B两部分，分别连接接头A或B，每种接头都含有 标签酶酶切位点。 c.标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接两个短cDNA 片段，构成双标签后以引物A和B扩增。 d.锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。 e.对标签数据进行处理。