琼脂糖凝胶电泳-完整整理
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编辑课件
影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小 2 凝胶的浓度 3 DNA的构象 4 使用的电压 5 琼脂糖的种类 6 电泳缓冲液 7 嵌入染料的存在
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影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小
2 凝胶的浓度
DNA的构象 碱3 基D对NA数分目子）大。小分迁子移越速大率，U摩与擦log阻N力成越反大比，（同N为时
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
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琼脂糖凝胶缓冲液
有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳
Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E 缓冲液） Tris-硼酸盐缓冲液(TBE) Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)
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分子生物学实验技术 专题
1
编辑课件
分子生物学实验技术专题
2
编辑课件
电泳技术简介
什么是电泳技术？ 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、
核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维 素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于 电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的 速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其 百分含量的方法。
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琼脂糖凝胶电泳特点
9
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琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
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琼脂糖凝胶缓冲液
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琼脂糖凝胶缓冲液
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琼脂糖凝胶缓冲液
TBE可以使用10次左右，而TAE用2~3次就要 更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条带 模糊或不规则DNA带迁移。
电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电 流加大，凝胶发热。
3
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电泳技术的分类
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电 泳（有支持体）两大类。
自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等 电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层 电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝 胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素 粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼 脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，
所4 以分使子大用的的迁移电慢。压 琼脂糖的种类 等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋>线
性5 DNA）
电泳缓冲液 形6 状一越般接来近说球，形分，子则带其的电电泳荷迁量移越速大度、越直快径。越小、
7 嵌入染料的存在
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影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小
溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰 FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无 关； 在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率 约与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲 苯氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4% 浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。
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琼脂糖凝胶载样缓冲液
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琼脂糖凝胶载样缓冲液
载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。 载样缓冲液有三个作用：
增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内； 使样品带有颜色便于上样操作； 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳 极迁移。
上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二 甲苯氰FF。
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琼脂糖凝胶载样缓冲液
注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的 溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。
5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置 处插上梳子。凝胶厚度一般在3－5 mm 之间。
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
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凝胶电泳技术
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
5
Baidu Nhomakorabea辑课件
琼脂糖凝胶电泳：实验原理
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依 氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此 该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、 鉴定及纯化。
7
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琼脂糖与琼脂的区别
琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶 （agaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是 D半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多 更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似， 但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除， 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取 代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的 移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比 较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在 0.13%以下。 简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身 独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
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琼脂糖凝胶的配置
3. 使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入 溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充 分混匀——不提倡使用。
6
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琼脂糖凝胶电泳：实验原理
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应 与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同 的区带。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值 成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分 子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同， 但构型不同的DNA 分子。
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影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小 2 凝胶的浓度 3 DNA的构象 4 使用的电压 5 琼脂糖的种类 6 电泳缓冲液 7 嵌入染料的存在
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影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小
2 凝胶的浓度
DNA的构象 碱3 基D对NA数分目子）大。小分迁子移越速大率，U摩与擦log阻N力成越反大比，（同N为时
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
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琼脂糖凝胶缓冲液
有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳
Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E 缓冲液） Tris-硼酸盐缓冲液(TBE) Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)
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分子生物学实验技术 专题
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分子生物学实验技术专题
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电泳技术简介
什么是电泳技术？ 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、
核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维 素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于 电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的 速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其 百分含量的方法。
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琼脂糖凝胶电泳特点
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琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
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琼脂糖凝胶缓冲液
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琼脂糖凝胶缓冲液
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琼脂糖凝胶缓冲液
TBE可以使用10次左右，而TAE用2~3次就要 更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条带 模糊或不规则DNA带迁移。
电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电 流加大，凝胶发热。
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电泳技术的分类
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电 泳（有支持体）两大类。
自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等 电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层 电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝 胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素 粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼 脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，
所4 以分使子大用的的迁移电慢。压 琼脂糖的种类 等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋>线
性5 DNA）
电泳缓冲液 形6 状一越般接来近说球，形分，子则带其的电电泳荷迁量移越速大度、越直快径。越小、
7 嵌入染料的存在
20
编辑课件
影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小
溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰 FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无 关； 在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率 约与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲 苯氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4% 浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。
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琼脂糖凝胶载样缓冲液
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琼脂糖凝胶载样缓冲液
载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。 载样缓冲液有三个作用：
增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内； 使样品带有颜色便于上样操作； 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳 极迁移。
上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二 甲苯氰FF。
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琼脂糖凝胶载样缓冲液
注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的 溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。
5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置 处插上梳子。凝胶厚度一般在3－5 mm 之间。
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
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凝胶电泳技术
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
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Baidu Nhomakorabea辑课件
琼脂糖凝胶电泳：实验原理
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依 氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此 该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、 鉴定及纯化。
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琼脂糖与琼脂的区别
琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶 （agaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是 D半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多 更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似， 但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除， 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取 代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的 移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比 较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在 0.13%以下。 简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身 独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
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琼脂糖凝胶的配置
3. 使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入 溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充 分混匀——不提倡使用。
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琼脂糖凝胶电泳：实验原理
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应 与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同 的区带。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值 成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分 子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同， 但构型不同的DNA 分子。