无菌检查方法学验证

无菌检查方法学验证

1．概述

将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作，并接种小于100cfu的试验菌，同时设置阳性对照，按规定温度培养3～5天，与各相应的阳性对照管比较：如含供试品各管中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查；如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用，并再重新进行验证试验。

2．验证前提条件

供试品的选择原则：相同配方，不同规格的制品，选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同，含量不同的制品，选择含量最高的制品进行验证。照此原则，多规格制品按下表选择供试品进行验证。

3. 验证方法

3.1菌液制备

3.1.1细菌菌液制备程序

①取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上，使均匀分布，置30～35℃培养18h～24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30～35℃培养18h～24h。同法操作，培养得第3代培养物。

②取生孢梭菌的冻干菌种管一支，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散后，吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上，使均匀分布，置30～35℃培养18h～24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜面上，于30～35℃培养18h～24h。取生孢梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18h～24h，得第3代培养物。

③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀，得初步菌悬液。

④取初步制成的上述菌悬液和生孢梭菌第3代新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。

3.1.2孢子悬液制备程序

①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散后，吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23～28℃培养5～7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上，同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物，同法操作，得第3代培养物。

②用 5.0ml吸管吸取 3.0ml～5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜面试管内，反复吹吸，洗脱孢子，用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证孢子悬液。

3.2 薄膜过滤

3.2.1供试品试验组

取规定量供试品，按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后，如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中；如为含防腐剂供试品，则待供试品过滤完后，连续3次用0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中，加入1ml验证菌液。每种制品抽取三批按上法操作。

3.2.2阳性对照组

取一套与供试品试验组相同的集菌培养器，不过滤供试品，直接向与供试品试验组相等量的培养基内接入1ml的验证菌液。

3.2.3阴性对照

取规定量供试品，按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后，往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，另一只滤筒内接入100ml硫乙醇酸盐流体培养基。

7.3.3.4培养

将硫乙醇酸盐流体培养基置于30～35℃培养，改良马丁培养基置于20～25℃，分别在培养的第1、2、3、4、5天观察并记录结果。

7.3.3.5可接受标准

所有验证用试验菌种均能在供试品组和阳性对照组中生长良好，并且同一试验菌在供试品组和阳性对照组中生长的时间及强弱应没有明显差异。阴性对照应无菌生长。各品种三批验证结果均应符合上述要求。