临床生物化学实验原理、方法及检测全解

临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术

中国中医研究院广安门医院临床检测中心

生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。

一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。

一、实验反应原理及分析方法（理论依据）

二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。

三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。

四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。

实验反应原理及分析方法(理论依据)

一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。

临床化学方法的分类

特别是自动生化仪方法的特点

以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。

在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。

但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速

度（V

o ）等等。测酶初速度（V

o

）只能用分光光度法。

因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。

生化自动分析仪特点：

1 精确测定反应的动态过程；

2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率；

3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。

分析方法的分类

临床化学常用方法按表1分类：

表1 分析方法分类

分析方法中的测定步骤

物理化学方法物理方法

平衡法动态法平衡法动态法

可变信号法固定信号法

在临床化学中绝大多数方法都是所谓物理——化学方法。也就是将所测定物质进行一些化学转化后再进行测定。例如在实际工作中测胆红质，不是直接在n m测定，而是先进行重氮化反应后比色定量测定生成的有色偶氮化合物。

绝大多数化学反应都经历一个类似图1的反应过程。

图中虚线明显将反应分为二个截然不同时期，左面期中所测的产物浓度在不断变化之中，由传感（Sensor）所得到的信号也在相应改变之中。如所用的方法主要是根据这期间所获得的信号进行计算，这称之为动态法。

相应在图中虚线右边时期，传感器所得到信号相对不变，如根据

这些信号计算的方法称之为平衡法。从科学上说此术语显然比终点法更为确切，因为信号无变化，不一定意味着反应完全达到终点。

正因为在这期内传感器所得到信息变化不大，因此对测定的条件如时间，浓度，PH……要求远没有动态法那样严格，所以不要求特殊仪器，而且精密度较高，非常适宜于一般仪器和实验室使用。

图1也同样适用于酶催化的反应，在动态期酶所催化产化的物质处在一个动态变化之中，在酶作用一段时间后，由于基质消耗逆反应出现，底物的抑制作用等，反应速率愈来愈慢，最后达到平衡期。此时基质和产物浓度不出现变化，因此很清楚如要测酶活性，只能在动态期测定酶所催化反应的速率。所以严格说测酶方法不论用自动生化仪，记录或分光光度计或普通比色计都包括在动态法的范围内。

平衡法（终点法）

这是目前我国生化实验室常用也是大家所熟悉的方法。其特点是对测定条件尤其是测定时间和温度要求不严格，所以容易掌握，计算结果方便，精密度好，但由于反应达到平衡需要一定时间，一般都需十分钟以上，因此整个操作时间长，工作效率低，目前不少自动生化仪特别是离心式分析仪改用动态法。即使采用平衡法时也对方法进行修改，设法缩短动态期。例如同是糖激酶——葡萄糖—6—磷酸脱氢酶法测血糖，手工法往往需15分钟后比色，但在自动生化仪中由于加大工具酶用量，在3分钟内就达到终点。另外应用计算机技术在每一个标本达到平衡时就可分别进行终点测定。

近年来有一种倾向就是将特异性较差的化学法改为特异性酶法。即以酶作为试剂来测定血中各种代谢物质。

这类方法和经典的平衡法有所区别，下面做一个简单叙述：

这类方法特点是被测物质（酶反应的基质）在酶反应过程中完全被转化或消耗掉（即达到反应终点），通常这类方法操作简单，一般不需要作标准管，通过一些已知的理化常数例如克分子吸光系数等不难将结果计算出来，其缺点是反应时间较长，特别不适合于离心式自动分析仪。另有少数酶反应，基质并未完全消耗掉，只是达到一个动态平衡，此时往往需要同时作标准管。

动态法(连续监测法)

动态法——即根据某一物质对一个反应的催化或延缓作用来测定期含量，这是通过秒表测量反应延缓时间而达到此点。

从六十年代开始，动态法得到迅速发展，这是由于一系列高技术发展的结果：出现了高质量的电化学和比色传感器，温度控制的比色杯，迅速混匀技术，以及自动数据处理系统等，人们避免了繁杂的计算，可以迅速直接得到测定结果，满足了临床医学大量生化标本的要求。反之动态法的使用也大大推动临床化学发展，仅用有限人力可以测定成十倍原来的工作量。如测酶活性全部使用此方法。

实验检测技术（生化分析仪的分析原理）

人体的供能、合成与代谢是由、糖（碳水化合物）、蛋白质、脂肪来完成的。临床上蛋白质的检测是测定蛋白质的20多种氨基酸，采用的是吸收光谱和分光光度法。