重组白细胞介素
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（3）高效液相层析：用HPLC仪进行纯化，用0.1%三氟乙酸平衡 Cl反相柱后 ，泵入rIL-2样品，进行乙啨梯度洗脱，收集活性峰， 低温减压下快速去除乙啨，即可得到rIL-2纯品。
简介
白细胞介素-2（ IL－2）是由Morgan和 Ruscetti发现的 由T细胞产生的一种淋巴因子，是一个分子质量为14500 的糖蛋白。可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(N K )和淋 巴因子激活的杀伤细胞(LAK)增殖，并升高其杀伤活性， 进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可促进干扰 素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌和抗体产生，是一种 免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等 作用。
4.降低毒性： 125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活性进一步提高，在
给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而 可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治 疗的进行。
2020/6/29
8
化学修饰：
对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力, 延 长其在体内的作用时间, 提高药效，降低或消除其在体内 的免疫原性。对IL-2 进行修饰的主要为PEG,。
3
2.抗病毒感染 3.对感染性疾病的治疗作用 4.对其他疾病的治疗：白介素-2 在急性白血病、抗高 血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。
2020/6/29
4
IL-2
一 级 结 构
2020/6/29
5
Βιβλιοθήκη Baidu 结构改造
IL-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中 共有三个半胱氨酸（cys)分别在第58、105、125位，其中 58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需，且易错配 或生成二聚体，降低生物活性。基因工程重组IL-2用点突 变的方法把125位的cys改成Ser或Ala，使IL-2分子稳定性增 强。如果用点突变的方法把58或105位的cys变成其他氨基 酸，则rIL-2的活性几乎完全丧失。
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改造后的优点
1.提高白细胞介素2的比活性
2.提高白细胞介素2的稳定性： 由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易
于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二 硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。 125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。
2020/6/29
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基因重组制备流程
T细胞mRNA 反转录
cDNA
IL-2 cDNA 文库的构建
利用探针杂交筛选 IL-2 cDNA阳性克隆
与质粒载体pBV220连接， 并转入大肠杆菌DH5a IL-2基因表达
分离纯化包涵体 溶解，复性，纯化
纯化的rIL-2
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一种制备方法：
1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选 出目的菌。
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4.（1）凝胶层析：取上清装入sephacrylus-200中，用PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-3至6Mol GuHcl充分平衡后上样，平衡液洗脱， 结果出现三个蛋白峰，收集第三峰，4 ℃保存；
（2）复性：取凝胶层析后样品，浓度为50mMol Tris.Hcl稀释三 倍，加氧化和还原性谷胱甘肽，至1mMol和5-10mMol，调PH使 为7-9，室温放置两小时，浓缩至10倍，过sephadex G25柱，用 PH3.0，浓度为0.1molGlyHcl平衡并洗脱，收蛋白峰。
2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30 ℃振荡培养810小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30 ℃下培养 11-13小时，再在42 ℃下培养5-6小时，发酵后收集菌体。
3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同 样缓冲液中，加溶菌酶，4 ℃下作用30分钟，冰浴超声至完全 破裂为止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为 50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT。搅拌下缓慢 滴加同体积PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA8mMol 尿素，室温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性 杂志，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-10mMol DTT-7至8Mol GuHCL,溶解1.5 小时后离心取上清在4 ℃保存。
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免疫作用机理： IL -2 能与任何能形成IL -2 受体的细胞, 如辅助
性T 细胞(T H ) 、细胞毒性T 细胞(T e ) 、B 细胞和自 然杀伤细胞结合, 但结合的强度以T c 细胞为最高。 IL -2 与相应受体结合后, 细胞即从G 相进入S 相 并开始分化增殖。
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1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2, 作用时间提高10 倍，而且免疫原性下降, 抗肿瘤性能提高, 毒副作用有所降低。
1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到 生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道; 随后白 介素-2 的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了 研究的热点。
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3.易于纯化： 在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原
剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2 。由 于125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫 键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异 构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性 降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而 有利于IL-2的纯化。
2
临床应用：
1. 肿瘤治疗： 在恶性肿瘤的发病机制中, 肿瘤病人的白介素-2 含量
较正常的水平低, 不能使NK、CT L、LAK 等杀伤细胞活化 和增殖, 使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外源 白介素-2, 帮助病人完成免疫监视功能, 这就是白介素-2 治疗 肿瘤的免疫学基础。
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简介
白细胞介素-2（ IL－2）是由Morgan和 Ruscetti发现的 由T细胞产生的一种淋巴因子，是一个分子质量为14500 的糖蛋白。可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(N K )和淋 巴因子激活的杀伤细胞(LAK)增殖，并升高其杀伤活性， 进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可促进干扰 素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌和抗体产生，是一种 免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等 作用。
4.降低毒性： 125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活性进一步提高，在
给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而 可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治 疗的进行。
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化学修饰：
对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力, 延 长其在体内的作用时间, 提高药效，降低或消除其在体内 的免疫原性。对IL-2 进行修饰的主要为PEG,。
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2.抗病毒感染 3.对感染性疾病的治疗作用 4.对其他疾病的治疗：白介素-2 在急性白血病、抗高 血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。
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IL-2
一 级 结 构
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Βιβλιοθήκη Baidu 结构改造
IL-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中 共有三个半胱氨酸（cys)分别在第58、105、125位，其中 58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需，且易错配 或生成二聚体，降低生物活性。基因工程重组IL-2用点突 变的方法把125位的cys改成Ser或Ala，使IL-2分子稳定性增 强。如果用点突变的方法把58或105位的cys变成其他氨基 酸，则rIL-2的活性几乎完全丧失。
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改造后的优点
1.提高白细胞介素2的比活性
2.提高白细胞介素2的稳定性： 由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易
于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二 硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。 125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。
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基因重组制备流程
T细胞mRNA 反转录
cDNA
IL-2 cDNA 文库的构建
利用探针杂交筛选 IL-2 cDNA阳性克隆
与质粒载体pBV220连接， 并转入大肠杆菌DH5a IL-2基因表达
分离纯化包涵体 溶解，复性，纯化
纯化的rIL-2
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一种制备方法：
1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选 出目的菌。
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4.（1）凝胶层析：取上清装入sephacrylus-200中，用PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-3至6Mol GuHcl充分平衡后上样，平衡液洗脱， 结果出现三个蛋白峰，收集第三峰，4 ℃保存；
（2）复性：取凝胶层析后样品，浓度为50mMol Tris.Hcl稀释三 倍，加氧化和还原性谷胱甘肽，至1mMol和5-10mMol，调PH使 为7-9，室温放置两小时，浓缩至10倍，过sephadex G25柱，用 PH3.0，浓度为0.1molGlyHcl平衡并洗脱，收蛋白峰。
2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30 ℃振荡培养810小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30 ℃下培养 11-13小时，再在42 ℃下培养5-6小时，发酵后收集菌体。
3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同 样缓冲液中，加溶菌酶，4 ℃下作用30分钟，冰浴超声至完全 破裂为止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为 50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT。搅拌下缓慢 滴加同体积PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA8mMol 尿素，室温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性 杂志，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-10mMol DTT-7至8Mol GuHCL,溶解1.5 小时后离心取上清在4 ℃保存。
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免疫作用机理： IL -2 能与任何能形成IL -2 受体的细胞, 如辅助
性T 细胞(T H ) 、细胞毒性T 细胞(T e ) 、B 细胞和自 然杀伤细胞结合, 但结合的强度以T c 细胞为最高。 IL -2 与相应受体结合后, 细胞即从G 相进入S 相 并开始分化增殖。
2020/6/29
1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2, 作用时间提高10 倍，而且免疫原性下降, 抗肿瘤性能提高, 毒副作用有所降低。
1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到 生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道; 随后白 介素-2 的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了 研究的热点。
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3.易于纯化： 在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原
剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2 。由 于125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫 键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异 构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性 降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而 有利于IL-2的纯化。
2
临床应用：
1. 肿瘤治疗： 在恶性肿瘤的发病机制中, 肿瘤病人的白介素-2 含量
较正常的水平低, 不能使NK、CT L、LAK 等杀伤细胞活化 和增殖, 使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外源 白介素-2, 帮助病人完成免疫监视功能, 这就是白介素-2 治疗 肿瘤的免疫学基础。
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