人重组白细胞介素-8在大肠杆菌的表达、鉴定

人重组白细胞介素-8在大肠杆菌的表达、鉴定
【摘要】目的利用PCR技术扩增hIL-8 cDNA，将其连接于原核表达载体pKpL-3a（含PL启动子）中,并在大肠杆菌中表达、鉴定。

方法PCR技术扩增hIL-8 cDNA获取目的基因，将该基因重组到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。

结果带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。

结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。

【关键词】hIL-8 PCR 重组基因表达
正文
趋化因子（Chemokine）是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。

白细胞介素-8（Interleukin-8）属于趋化因子家族成员，其分子中含有Cys-X-Cys的三联氨基酸序列，因而属于CXC趋化因子亚家族（α家族）。

IL-8的重要生物学功能是对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。

另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。

由于天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产。

其基本过程是：获取目的基因；表达载体的选择和构建；目的基因与表达载体的拼接；重组DNA分子转化到大肠杆菌；使其复制转录并合成重组的免疫分子。

利用重组技术, 可使大肠杆菌成为生产IL-8的生物工厂。

这种生物工厂一旦建造成功, 只要供给大肠杆菌适当的生长条件, 就可提供取之不尽的IL-8。

1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 菌株与载体
Pop2136大肠杆菌和含pKpL-3a质粒的大肠杆菌由本实验室提供。

1.1.2 工具酶与试剂
TaqDNA聚合酶及其buffer购于北联生物医学工程公司。

dNTPmix购于Takara 公司。

Klenow酶购于北联生物医学工程公司。

内切酶StyⅠ、XbaⅠ购于Takara 公司。

T4 DNA连接酶及其buffer购于Takara公司。

1.1.3 PCR引物的设计、合成
上游5ˊ引物：agt gct aaa gaa ctt aga tgt；
下游3ˊ引物：ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct(内含XbaⅠ酶切位点和TAA 终止密码)由Takara公司合成。

1.1.4 主要仪器
PCR仪，微量加样器（20μl、200μl、1000μl），高速台式离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，水浴摇床，孵箱，酶标仪，一次性酶标板等。

1.2 试验方法
1.2.1 PCR技术扩增hIL-8cDNA
在Eppendorf管中依次加入下列成份构建总体积为50μl的反应体系：ddH2O 37μl、10×buffer 5μl、dNTPmix 5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA模板1μl、Taq酶1μl。

调节PCR仪，设置95℃预变5分钟。

94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，反应30个循环。

最后72℃再延伸5分钟。

在设定好的PCR仪上进行反应。

反应结束后取出10μl进行琼脂糖凝胶电泳。

向管中余下的40μl反应体系中加入Klenow酶1μl，室温30分钟，以修平扩增片段的3ˊ末端。

之后转至1.5ml离心管中，加入50μl酚-氯仿-异戊醇并混匀，10000rpm，30秒离心。

吸取上层清液转至另一已加入5μl 3M NaAc的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，-20℃放置1小时。

10000rpm，10分钟离心，弃上清，加入0.5ml 70%乙醇，10000rpm，5分钟离心，弃上清，空气中干燥，溶于20μl TE。

1.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
配置0.8%琼脂糖凝胶板。

充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（×1），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。

DNA样品10μl加5μlGEBS 样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。

稳压电泳80v约2小时，是溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5v/cm。

取出凝胶板置溴化乙锭中染色20分钟。

在凝胶成像仪观察结果。

1.2.3 质粒提取
从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。

取菌液1ml转至Eppendorf管中，8000rpm，2分钟离心，弃上清。

加入200μl缓冲液A，充分混匀。

加200μl碱溶液裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。

加200μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次混匀，冰浴10分钟（宁短勿长）。

10000rpm 5分钟离心，上清转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时。

10000rpm 5分钟离心，弃上清，加入70%乙醇0.5ml。

10000rpm 5分钟离心，弃上清，干燥。

加入50μl TE使质粒溶解，酶切备用。

1.2.4 限制性内切酶消化
取两个Eppendorf管分别标记A、B，依次加入下列物质构建两个反应体系。

A管：ddH2O 16μl 、10×H buffer 2μl、质粒DNA 1μl、StyⅠ1μl。

B管：ddH2O 14μl 、10×M buffer 2μl、0.1%BSA 2μl、PCR产物1μl、XbaⅠ1μl。

37℃水浴45分钟。

A管中加入1μl Klenow酶、2μl dNTPmix，室温30分钟，加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一Eppendorf管中，加100μl 无水乙醇、4μl乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时。

10000rpm 10分钟离心，弃上清，100μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。

加入2μl 10×M buffer、2μl 0.1%BSA、1μl
XbaⅠ，37℃水浴45分钟。

加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一Eppendorf管中，加100μl无水乙醇、4μl乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时。

10000rpm 10分钟离心，弃上清，100μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。

加20μl TE进一步用于连接反应。

B管中加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一Eppendorf管中，加100μl无水乙醇、4μl乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时。

10000rpm 10分钟离心，弃上清，100μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。

加20μl TE进一步用于连接反应。

1.2.5 DNA连接
在Eppendorf管中加入下列物质构建反应体系进行连接反应：H2O 9.5μl、10×T4 DNA连接酶buffer 2.5μl、pKpL3α质粒DNA 7μl、IL-8 PCR产物5μl、T4 DNA 连接酶1μl。

置12-16℃水浴反应过夜。

65℃水浴15分钟，灭活T4 DNA连接酶，用于转化。

1.2.6 转化
将无质粒大肠杆菌pop2136接种于1ml LB培养基37℃培养3-5小时。

待OD600=0.4时转移至Eppendorf管中，8000rpm 2分钟离心，弃上清。

加200μl 100mM Cacl2混匀，冰浴30分钟。

加10μl连接好的质粒DNA，混匀，冰浴30分钟，37℃水浴2分钟，冰浴2分钟。

加入1ml LB培养基，37℃培养0.5小时。

取出50μl涂于LA培养皿上（含氨苄青霉素），37℃倒置培养过夜，检查转化菌是否生成(只有转化的细菌才能在平皿上生长)。

1.2.7 细胞因子的测定—ELISA双抗体夹心法
包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，放置湿盒中，4℃24小时。

洗涤：加入洗涤液洗涤1分钟/次，共3次。

加样：加入待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，放置湿盒中，37℃ 30分钟。

洗涤：同前。

加酶标抗体：100μl/孔，100μl/孔，放置湿盒中，37℃ 30分钟。

洗涤：同前。

加显色剂：A液（TMB，四甲基联苯胺）1滴，B液（H2O2）1滴，室温显色5-10分钟。

终止反应：加中止液（2mol/L H2SO4）。

测OD值：酶标仪测450nm处OD 值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳见图1。

检查扩增结果，9组都见一致的扩增区带，PCR产物与设计的228bp相符，并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。

1 2 3 4 5 6 7 8 9
图1 DNA琼脂糖凝胶电泳分析
注：PCR Products:228bp
2.2 ELISA双抗体夹心法检测IL-8含量所测OD值和标准曲线见表1和图2。

表1 450nm处OD值
4
组
Measurement count:
1 Filter: 450
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A
B 0.81 0.485 0.914 1.654 0.445 0.614 1.7 0.241 1.503 0.155
C 0.735 0.633 0.939 1.702 0.449 0.364 1.415 0.383 1.412 0.754
D 0.836 0.618 0.921 1.237 0.366 0.384 1.339 0.352 1.481 0.261
E 0.861 0.747 1.169 1.84 0.358 0.575 0.343 0.542 0.226 0.11
F 0.321 1.198 1.51 2.136 0.704 0.882 0.704 1.108 0.55 0.192
G 0.377 1.565 2.198 1.876 0.448 0.654 0.612 0.949 0.915 0.408
H
图2 ELISA双抗体夹心法标准品OD值标准曲线根据标准品的浓度和试验所测OD值，计算出待测样本的hlL-18浓度为10.4ng/ml。

3 讨论
本实验首先通过PCR技术扩增hlL-18cDNA，反应结束后取出少量做琼脂糖凝胶电泳，根据图1的结果可以看出，引物的设计和PCR反应条件的设计是很成功的。

而在PCR反应中，引物的设计尤为重要。

引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发ZML聚合反应（即错配）。

具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素。

引物的长度一般为15~30bp，常用的是18~27bp，但不应大于27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[1]；引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配[1]；末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A；引物序列的GC 含量一般为40%~60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大［2］;引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4（G+C）+2(（A+T）;引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

而本试验酶切位点设计在下游3’引物上，并且增加了ccg三个碱基来保护酶切位点，是酶切更高效[3]。

把PCR产物和提取的质粒DNA进行限制性内切酶消化，然后进行DNA的连接。

将hlL-8cDNA片段插入pKpL3α质粒中，有三种方法可选。

一是两个平端连接；二是两个粘端连接；三是一个平端和一个粘端连接。

分析这三种连接方法，第一种方法优点是设计简单，但是缺点也很明显，连接反应慢、片段位置易倒置、容易形成多个重复序列等。

第二种方法优点是连接紧密，特异性高，但酶切位点设计比较复杂。

所以综合以上情况，本实验采用第三种办法。

3’端用Klenow酶补齐，5’端用XbaⅠ进行酶切，使之产生互补粘端。

经过转化处理后，小批量
诱导hlL-8表达，经纯化后，进行ELISA双抗体夹心法检测，由图2可以大致估算出hlL-8的浓度[4]。

另外，经转化的大肠杆菌在LA平皿上进行培养，长出的大肠杆菌说明其细胞均内含有质粒，但不能说明其质粒中都含有目的基因片段。

所以要对培养出的大肠杆菌做进一步的鉴定。

由于本实验没有做这一步，所以有必要在这里讨论一下。

挑单个菌落接种于1ml LA培养基中，30℃培养后可进一步提取质粒进行DNA 电泳；或者用限制性内切酶酶切后进行DNA电泳，看是否含有目的基因片段。

还可以小批量诱导重组IL-8表达，然后进行SDS-PAGE电泳，鉴定重组蛋白的分子量。

本试验成功地构建了hlL-18重组原核表达质粒，利用大肠杆菌成功地表达了重组蛋白，为进一步研究hIL-18的功能及应用打下了基础。

参考文献
[1] 张成岗，贺福初. 生物信息学方法与实践[M]. 北京：科学出版社，2002, 64,-66.
[2] 贺林. 解码生命-人类基因组计划和后基因组计划[M]. 北京：科学出版社，2000, 346-348.
[3] 张新宇，高燕宁. 生物信息学[J]. 2004(04): 16-19.
[4] 分子免疫学实验指导.。