荧光素酶活性实验

荧光素酶活性实验

（1）.以5*104的细胞/孔接种于24孔板中，24hr后用磷酸钙转染，转染所有所需的DNA。包括受体表达载体、包含荧光素酶报告基因的各种表达质粒和B-gal半乳糖苷酶表达质粒共转入细胞中。

(2).弃去培养液后，PBS洗一次，每孔加入120ul裂解液，4℃放置10min，13000rpm离心5min，取上清。

（3）.B-gal半乳糖苷酶活性测定：

配制B-gal半乳糖苷酶活性测定液：880ul ONPG+40ul 100*镁离子溶液+2280ul 0.1M磷酸盐缓冲液。每个样品加入B-gal测定液120ul和细胞裂解液20ul。

以上混合液于37℃孵育至有黄色出现为止，加入60ul 1M的Na2CO3终止反应。于酶标仪410nm 测定吸收值，以此作为B-gal半乳糖苷酶的相对活性，用于内对照，已标定转染效率。（4）.荧光素酶活性测定：

将20ul的细胞裂解液（用细胞裂解液补至100ul）与10ul的荧光素酶检验试剂（Lueiferin solution荧光素一管和ATP一管）混匀，立即用sepctrafluor plus检测发出的荧光信号，该荧光值与相对应的B-gal半乳糖苷酶的OD值之比为标定后的荧光素酶的相对活性。

附:试剂配方：

磷酸盐缓冲液：NaHPO4， Na2HPO4 pH7.3 详细配法见分子克隆

100*镁离子溶液(0.1M MgCL2, 5M B-巯基乙醇)

ONPG 4mg( O–nitropheny-B-D-galactopyanoside)溶于1ml 0.1M磷酸盐缓冲液

Lueiferin solution:10 mg Lueiferin溶于36ml 5Mm KH2PO4(pH7.8),分装成432ul每管.储存于-80℃.用前应先于室温放30min, 注意避光。

ATP:25 ml 1M Tris+5ml 1M MgCL2 + 0.48gATP分装成120ul每管.储存于-80℃.

0.1M PBS 溶液，以1L量为例：

NaCl 80g 9

Na2HPO4·12H2O 32.3g

NaH2PO4·2H2O 4.5g

（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠，最常见，不怎么吸潮，

如果你有无水的这两种磷酸盐也行，换算一下即可，无水的容易吸潮。）

加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.2，最后定容为1000mL。