GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤分解
脂肪酸提取试剂
脂肪酸提取试剂：试剂1-皂化试剂：NaOH 45.0 g，甲醇（色谱纯）150 mL，去离子水150 mL；试剂2-甲基化试剂：6.0 N 盐酸325 mL，甲醇（色谱纯）275 mL；试剂3-萃取溶剂：己烷（色谱纯）200 mL，甲基叔丁醚（色谱纯）200 mL；试剂4-碱洗涤剂：NaOH 10.8 g，去离子蒸馏水900 mL；试剂5-饱和NaCl：NaCl 40.0 g，去离子蒸馏水100 mL。
（1）获取菌体将培养出的微生物（细菌用TSBA培养基），取四区划线法之第三区，约40mg 左右的量，涂抹在teflon螺盖试管底部，同时做好标记。
（2）皂化1）吸取1.0mL(±0.1) 的试剂1，注入试管内，将含Teflon内垫的螺旋盖旋紧，涡旋振荡5-10 s，2）将试管放入95-100 ℃的水浴槽中5min，3）取出试管，稍冷却，不要旋松盖子，涡旋振荡5-10 s，4）放回95-100℃的水浴槽中25 min，注意盖子是否旋紧，5）取出试管，以自来水冷却。
（3）甲基化1）打开螺旋盖，加入2.0mL的试剂2，2）旋紧螺盖，涡旋振荡5-10 s，3）放入80 ℃的水浴槽中10 min，4）取出试管，以自来水冷却。
（4）萃取1）打开螺旋盖，加入1.25mL的试剂3，2）旋紧螺盖，缓慢将试管上下混匀10 min，3）打开螺盖，用玻璃滴管取出下层液体，保留上层液体。
（5）洗涤1）加入3.0mL的试剂4，2）旋紧螺盖，缓慢将试管上下混合5 min，3）静置分层，若分层不够清晰，加入4-5滴的饱和NaCl溶液，4）用玻璃滴管取出2/3的上层液体，移到GC小管中，注意不要取到下层。
全二维气相色谱 四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸
2012年11月Vol.30No.11November 2012Chinese Journal of Chromatography1166~1171研究论文DOI :10.3724/SP.J.1123.2012.06041∗通讯联系人:潘家荣,博士,教授,研究方向为食品安全.E-mail :panjr @.基金项目:国家科技支撑计划课题(2011BAK 10B 04).收稿日期:2012-06-28全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸郑月明1,2,㊀冯㊀峰2,㊀国㊀伟2,㊀储晓刚2,㊀潘家荣1,3∗,㊀贾㊀玮2(1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;2.中国检验检疫科学研究院,北京100123;3.中国计量学院,浙江杭州310018)摘要:建立了植物油脂中31-四极杆质谱(GC ˑGC-qMS )分析方法㊂样品经甲酯化衍生后,以DB-1柱(30m ˑ0．25ˑ25)柱(3．2m ˑ0．1mm ˑ0．1μm )作为二维柱组成柱系统进行分离,在调制周期为3．5s ㊁四极杆质量扫描范围为m /z 40~350的条件下,植物油脂中31种脂肪酸成分可以在50min 内得到准确和灵敏的检测㊂将本方法应用于实际样品的分析,灵敏度较传统的气相色谱-质谱法提高了100倍以上,㊂分析提供了新的技术手段,同时对于确保食用植物油的质量安全㊁㊂关键词:全二维气相色谱-四极杆质谱;脂肪酸;植物油中图分类号:O 658㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:1000-8713(2012)11-1166-06㊀㊀分是由一分子甘油和三分子脂肪酸合成的甘油三酸酯,另外还有少许游离脂肪酸㊂研究表明,植物油中的脂肪酸种类及含量对人体健康有重要影响[1]㊂㊀第11期郑月明,等:全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸由于不同种类的植物油以及同一种类但来自于不同产地或是不同采收期的植物油所含脂肪酸种类㊁含量也都有一定差异[2,3],因此建立植物油中脂肪酸组成和含量的分析方法,获取不同种类食用植物油的特征脂肪酸标识物,对于确保食用植物油的质量安全,消除食用植物油的掺假伪劣等都有重要意义㊂㊀㊀法报道,例如气相色谱法㊁分析中发挥了较大的作用,但是由于植物油中的脂肪酸成分复杂,且有许多脂肪酸的含量较低,使用上述方法可能无法对植物油中的所有脂肪酸进行准确识别和定量㊂近年来,全二维气相色谱串联飞行时间质谱技术(GCˑGC-TOF MS)由于其高峰容量㊁高分离度及高灵敏度而受到广大分析工作者的重视,其在复杂基质成分分析等领域也已经显示了明显的优越性[7-9]㊂但采用全二维气相色谱串联四极杆质谱(GCˑGC-qMS)进行植物油中脂肪酸成分分析的研究尚未见报道㊂本研究建立了植物油中脂肪酸成分的GCˑGC-qMS定性定量分析方法,一些植物油中微量的脂肪酸成分也得到了识别㊂1㊀实验部分1.1㊀仪器、试剂与材料㊀㊀QP2010Ultra GCˑGC-MS仪(日本,岛津公司)配冷喷调制器ZX1(美国Zoex公司),一维数据采集由GC-MS solution2．5软件完成,二维数据采集由GC Image R2．2完成㊂㊀㊀37种混合脂肪酸甲酯标准品(Sigma公司);甲醇和正己烷(HPLC级,Fisher公司);13%~15%三氟化硼甲醇溶液(上海安普科学仪器有限公司);正庚烷㊁无水Na2SO4(500ħ灼烧4h,置于干燥器中备用)(天津市化学试剂一厂)㊂所用试剂除特别标注外,均为分析纯㊂0．45μm聚四氟乙烯(PTFE)膜(Waters公司)㊂㊀㊀标准溶液配制:取500μL质量浓度为10g/L 的混合脂肪酸甲酯标准溶液用正己烷定容至5mL,作为标准储备液,密封后置于4ħ保存㊂㊀㊀花生油㊁玉米油㊁葵花油㊁大豆毛油㊁橄榄油㊁橄榄葵花油,市售㊂1.2㊀色谱-质谱条件㊀㊀一维色谱柱:DB-1(30mˑ0．25mmˑ0．25μm)(REXTEK,美国);二维色谱柱:DB-Wax(3．2 mˑ0．1mmˑ0．1μm)(Agilent,美国)㊂进样口温度250ħ;恒线速度操作模式;进样量为1μL,分流比10ʒ1;程序升温:140ħ保持5min,以4．5ħ/min升温至200ħ,再以1．5ħ/min升温至240ħ保持10min;离子源温度230ħ;电离能量70 eV;检测器电压0．98kV;接口温度250ħ;质量扫描范围m/z40~350;冷气流量7L/min,热气温度370ħ;调制周期3．5s;热喷时间350ms㊂1.3㊀脂肪酸的衍生化处理植物油中脂肪酸的衍生参考脂肪酸检测的国家,简述如下:准确称取0．100g植物油置于100mL平底烧瓶中,加入8mL20g/L氢氧化钠-甲醇溶液,连接回流冷凝器,80ħ水浴直至油滴;7mL,继续水浴回流2min㊂将平底烧瓶取出水浴锅并冷却至室温后,准确加入10mL正庚烷并振摇2min,再加入饱和氯化钠溶液,静置分层,取适量上清液加入4g无水硫酸钠,振荡1min后静置5min,取上层清液稀释适当倍数,经0．45μm有机滤膜过滤待测㊂2㊀结果与讨论2.1㊀GCˑGC-MS条件优化2.1.1㊀色谱柱的选择㊀㊀GCˑGC-MS的色谱柱系统由2根具有不同极性的气相色谱柱通过一个冷喷调制器连接而成,这种组合使得分析物可以同时按沸点和极性两方面性质的差异获得分离,因而有效地提高了整个色谱系统的峰容量和分离度㊂同时由于冷喷调制器的冷冻聚焦作用,使得分析物的色谱峰变得尖锐,从而提高了灵敏度[11]㊂为了获得最大的峰容量和分离度,本研究对GCˑGC-MS中的色谱柱系统进行了优化,由于化合物在经过二维气相色谱柱的时间必须要小于冷喷调制器的一个工作周期,所以二维色谱柱一般选用柱长较短的极性色谱柱㊂本研究选择DB-Wax作为二维色谱柱,该色谱柱以聚乙二醇为固定相,可根据化合物的极性不同从而达到较好的分离㊂㊀㊀本研究主要选用了3种一维色谱柱进行对比分析,以确定最优柱系统㊂首先考察了与DB-Wax极性有明显差异的DB-1型非极性色谱柱和Rxi-5sil 型弱极性色谱柱(二者均为30mˑ0．25mmˑ0．25μm,REXTEK,美国)对脂肪酸成分的分离效果㊂结果表明,一维柱为Rxi-5sil时的分离效果要明显差于一维柱为DB-1时的分离效果㊂图1为C18和C20类脂肪酸在上述2个色谱柱系统上的分离谱图㊂在此基础上,又比较了DB-1型色谱柱(长度均为30m,内径0．25mm)固定相涂层的厚度对脂肪㊃7611㊃色谱第30卷酸分离的影响,结果表明尽管1μm 膜厚的分离效果稍优于0．25μm 膜厚的分离效果,但柱流失严重,易干扰微量脂肪酸成分的分析,因此,本研究最终确定的柱系统中一维柱使用0．25μm 膜厚的DB-1气相色谱柱,二维柱使用DB-Wax 型色谱柱进行油脂中脂肪酸的分析㊂图1㊀不同柱系统下脂肪酸甲酯的分离情况Fig.1㊀Separation of fatty acid methyl esters by different column systems㊀1D column :DB-1or Rxi-5sil (30m ˑ0．25mm ˑ0．25μm );2D column :DB-Wax (3．2m ˑ0．1mm ˑ0．1μm );GC temperature pro-gram :140ħfor 5min ,rise to 200ħat 4．5ħ/min ,200-240ħat 1．5ħ/min ,hold at 240ħfor 10min ;injector temperature :250ħ;ion source temperature :230ħ;MS transfer line :250ħ;electron ionization :70eV ;scan range of m /z :40-350;inject volume :1μL ;split ratio :10ʒ1;modulation period :3．5s ;hot pulse (370ħ):350ms ;liquid N 2flow :7L /min.㊀1.C 18ʒ3n 6;2.C 18ʒ3n 3;3.C 18ʒ2n 6c ;4.C 18ʒ2n 6t ;5.C 18ʒ1n 9c ;6.C 18ʒ1n 9t ;7.C 18ʒ0;8.C 20ʒ5n 3;9.C 20ʒ4n 6;10.C 20ʒ3n 6;11.C 20ʒ3n 3;12.C 20ʒ2;13.C 20ʒ1;14.C 20ʒ0.2.1.2㊀冷喷调制器参数优化㊀㊀冷喷调制器是二维色谱的核心部件,其中包含冷喷气和热喷气两路气体,分析物从第一根色谱柱流出,经冷喷气低温聚焦后再由热喷气高温脱附释放到第二根色谱柱中㊂在二维色谱运行过程中,冷喷气持续释放,热气脉冲式喷射,前后两次热喷之间的时间称为调制周期(Pm ),每次热气释放的时间称为热喷时间[12]㊂㊀㊀冷喷气的流速对于不同化合物有所不同,此处温度需低于化合物流出温度120~140ħ方可达到捕集聚焦效果,对于碳数为4~40的化合物来说,其所需冷气量随碳数增加逐渐降低,一般为15．5~1．5L /min [13]㊂通过观察本研究中的目标分析物在不同冷气量条件下的一维色谱峰是否被切开,确定冷气量为7L /min ㊂㊀㊀调制周期时间对目标分析物在二维色谱上的信号强度和分离情况有重要的影响,过短的调制周期时间会导致一个化合物被分割在多个调制周期从而导致信号强度降低,另外可能使二维保留时间超过调制周期的化合物在下一个周期与下一个周期的化合物共流出;过长的调制周期会降低一维色谱的切割次数使其不足3次,降低一维色谱的分辨率㊂图2为不同调制周期下棕榈酸(C 16ʒ0)在二维色谱上的响应情况㊂由图2可以看出,调制周期为3s 时,其信号强度为另两个调制周期(3．5s 和4s )的1/10;调制周期为3．5s 和4s 时棕榈酸的信号强度尽管在同一个数量级,但3．5s 时信号强度更高些㊂另外18碳脂肪酸在3．5s 调制周期下的分离情况较4s 时的效果好(见图3)㊂因此,本研究的调制周期最终定为3．5s ㊂㊀㊀对于热喷时间,分别考察了250㊁300㊁350ms ,其中350ms 使得目标物在一维色谱柱上基本不拖尾,即这段时间恰好将分析物释放到二维色谱柱中,二维进样时间刚好合适㊂㊃8611㊃㊀第11期郑月明,等:全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸图2㊀不同调制周期时间下棕榈酸甲酯(C 16ʒ0)在二维色谱上的色谱图Fig.2㊀Slice profile of GC ˑGC of palmitic acidmethyl ester (C 16ʒ0)under different modulation periods (Pm )㊀1D column :DB-1;2D column :DB-Wax.Other conditions as in Fig ．1.图3㊀不同调制周期下18碳脂肪酸的二维色谱图Fig.3㊀GC ˑGC contour plots of fatty acid chains with18carbons under different modulation periods㊀1D column :DB-1;2D column :DB-Wax.Other conditions as in Fig ．1.2.1.3㊀质谱扫描质量范围的确定㊀㊀为了对植物油中所有可能存在的脂肪酸进行识别和检测,需要采用全扫描模式进行分析㊂由于二维色谱峰非常窄,一般为0．1~0．6s ,为增加定性定量的准确度和灵敏度,需要使用尽可能高的扫描频率㊂四极杆型质谱检测器扫描的质量范围大小与扫描频率成反比,为提高扫描频率,需要选择尽量窄的质量范围㊂考虑到植物油中的脂肪酸甲酯通常含有的离子,且响应较高,为保证谱图的完整性,起始扫描质荷比需设为40;对于扫描质荷比的上限,尽管本研究使用的37种脂肪酸甲酯混合24个碳原子的脂肪酸,但植物油中的脂肪酸一般为10~22个碳原子[14],质量数在350以内,因此对于混合标准品中大于22个碳原子的脂肪酸(C 23ʒ0,C 24ʒ0,C 24ʒ1),本研究未作检测,仅选择350为扫描的最大质荷比㊂在上述质量范围内,当设定四极杆的扫描速率为20000amu /s 时,扫描频率可达33．3Hz ,此时一个二维峰包含9~12个点,保证了化合物的准确定性定量㊂此外,根据国家标准,本研究使用的溶剂为正庚烷,如果要检测37种脂肪酸甲酯混合标准品中小于10个碳原子数的3种脂肪酸(C 4ʒ0,C 6ʒ0,C 8ʒ0),必须要降低并延长起始温度的时间,而植物油中几乎不含小于10个碳原子数的脂肪酸,因此不检测这3种脂肪酸并不影响对植物油中脂肪酸的分析㊂图4即为优化条件下剩余的31种脂肪酸甲酯混合标准品(C 10~C 22)的二维色谱图㊂图4㊀脂肪酸甲酯混合标准品的二维色谱图Fig.4㊀GC ˑGC contour plot of mixed fatty acidmethyl ester standards㊀1D column :DB-1;2D column :DB-Wax.Other conditions as in Fig.1.2.2㊀灵敏度的比较㊀㊀为了考察GC ˑGC-qMS 相对于传统的GC-MS的灵敏度,本研究比较了优化条件下脂肪酸甲酯在GC ˑGC-qMS 和GC-MS 上信噪比的差异㊂其中图㊃9611㊃色谱第30卷5a 为肉豆蔻酸在一维色谱上的响应情况,图5b 为肉豆蔻酸在二维色谱时的响应情况㊂肉豆蔻酸在二维色谱上被调制成3个碎片峰,其信号响应强度比一维色谱提高了20倍以上,信噪比则比一维色谱提高了100倍以上㊂图5㊀肉豆蔻酸甲酯(C 14ʒ0)在(a )一维色谱和(b )二维色谱上的灵敏度Fig.5㊀Sensitivities of myristic acid methyl ester (C 14ʒ0)on (a )GC-MS and (b )GC ˑGC-qMS表1㊀不同植物油样品中脂肪酸的含量Table 1㊀Contents of fatty acids in different vegetable oils%Fatty acidBean oil Corn oil 1Corn oil 2Sunflower oil 1Sunflower oil 2Oliveoil 1Olive oil 2Olive oil 3Olive sunflowerblend oilC 14ʒ0(肉豆蔻酸)0.06-------0.17C 15ʒ0(十五烷酸)--------0.07C 16ʒ0(棕榈酸)11.7013.0212.725.766.0616.8011.3410.198.10C 16ʒ1(棕榈油酸)-----1.2570.7300.5870.20C 17ʒ0(十七烷酸)0.13-------0.14C 17ʒ1(十七烯酸)--------0.08C 18ʒ0(硬脂酸)3.991.831.965.775.672.043.903.409.11C 18ʒ1n 9c (油酸)20.0831.5630.4321.3222.1564.7075.5977.0231.49C 18ʒ1n 7c (异油酸)1.300.710.800.550.533.202.452.301.15C 18ʒ2n 6c (亚油酸)53.5352.0052.9965.5264.6410.885.055.5346.51C 18ʒ3n 6(γ-亚麻酸)0.070.060.09--0.05---C 18ʒ3n 3(α-亚麻酸)8.500.450.63--0.520.630.73-C 20ʒ0(花生酸)0.350.380.370.280.280.450.310.230.82C 20ʒ1(花生烯酸)--------0.38C 20ʒ3n 6(11,14,17-顺-二十碳三烯酸)--------0.11C 20ʒ3n 3(8,11,14-顺-二十碳三烯酸)--------0.10C 22ʒ0(山芋酸)0.27--0.350.60---1.57Saturated fatty acid (饱和脂肪酸)16.5115.2315.0612.6212.6819.2915.5413.8219.98Monounsaturated fatty acid 21.3932.2731.2321.8622.6868.2678.7879.9133.30(单不饱和脂肪酸)Polyunsaturated fatty acid62.1152.5253.7265.5264.6411.465.686.2646.72(多不饱和脂肪酸)㊀-:not detected.2.3㊀定性和定量分析方法㊀㊀本研究中31种脂肪酸的定性,主要通过将标准品二维谱图中各峰点质谱图导入NIST 谱库检索的方式而实现;对于谱图接近㊁无法识别的几种顺式/反式异构体种类,则是通过单一标准品进样的方式进行判定㊂结果表明本研究所检测的31种脂肪酸都得到了较好的分离,未发现在二维色谱上出现重组的现象㊂㊀㊀由于本研究旨在确定不同油脂中脂肪酸组成的差异,所以无须对脂肪酸的绝对含量进行确定㊂考,其在质谱上的响应值相,因积归一化法测定脂肪酸的相对含量㊂2.4㊀实际样品分析㊀㊀本研究选取市场上包括大豆油㊁玉米油㊁葵花油㊁橄榄油及橄榄葵花调和油等5种植物油进行了定性定量分析(结果见表1)㊂从表1可以看出,上述植物油均以不饱和脂肪酸为主要成分,但各成分含量差异显著㊂橄榄油以油酸为主,含量高达64．70%~77．02%;大豆油㊁玉米油㊁葵花油以亚油酸为主,含量分别为52．00%~65．52%;5种油中除葵花油㊁橄榄葵花油外均含0．5%左右的亚麻酸,其中大豆毛油的亚麻酸含量较高,为8．50%㊂文献[15]报㊃0711㊃㊀第11期郑月明,等:全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸道,亚麻酸是大豆毛油的豆腥味来源之一,本研究的结果进一步证明了这一结论㊂比较脂肪酸的组成和含量可以看出,上述5种植物油中橄榄葵花油的脂肪酸组成最为复杂㊂图6即为橄榄葵花油样品脂肪酸成分的二维色谱图,在识别出的15种脂肪酸当中,除了传统方法所能检出的脂肪酸外,还检出了8,11,14-顺-二十碳三烯酸(0．10%-顺-二十碳三烯酸(0．11%)㊁十五烷酸酸(0．14%)㊁十七烯酸(0．08%)图6㊀橄榄葵花调和油样品的二维色谱图Fig.6㊀GCˑGC contour plot of olive sunflower blend oil ㊀1D column:DB-1;2D column:DB-Wax.Other conditions as in Fig．1.3㊀结论㊀㊀本研究建立了植物油脂中脂肪酸成分的全二维气相色谱-四极杆质谱分析方法㊂相对于传统的气相色谱-质谱法,本方法的灵敏度提升了100倍以上㊂将本方法应用于市售植物油样品的检测,不仅常规脂肪酸的检测结果与传统的方法相一致,而且一些微量的脂肪酸在部分样品中被检出㊂这表明,使用全二维气相色谱-四极杆质谱法进行食用油脂样品的脂肪酸分析检测可以有效确保检测结果的可靠性和准确度㊂该方法可望在保障食品安全过程中发挥重要作用㊂参考文献:[1]㊀Bi Y L.Oil Chemistry.Beijing:Chemical Industry Press(毕艳兰.油脂化学.北京:化学工业出版社),2005 [2]㊀Torres Vaz-Freire L,Gomes da Silva M D R,Costa Freitas AM.Anal Chim Acta,2009,633:263[3]㊀WU N N.[MS Dissertation].Zhengzhou:Henan Universityof Technology(吴娜娜.[硕士学位论文].郑州:河南工业大学),2008Li Li,Miao X L.Food Science and Technology (,苗笑亮.食品科技),2008,34(3):259 [5]㊀Wu H Q,Huang X L,Lin X S,et al.Chinese Journal ofAnalytical Chemistry(吴惠勤,黄晓兰,林晓珊,等.分析化学),2007,35(7):998[6]㊀Liang N N,Zhang L X,Wang X L,et al.Chinese Journal ofAnalytical Chemistry(梁楠楠,张良晓,王向利,等.分析化学),2011,39(8):1166[7]㊀Purcaro G,Tranchida P Q,Dugo P,et al.J Sep Sci,2010,33:2334[8]㊀Indrasti D,Che Man Y B,Mustafa S,et al.Food Chemis-try,2010,122:1273[9]㊀Herrero M,Ibánez E,Cifuentes A,et al.J Chromatogr A,2009,1216:7110[10]㊀GB/T22223-2008[11]㊀Mostafa A,Edwards M,Gorecki T.J Chromatogr A,2010.doi:10．1016/j.chroma.2012．02．064[12]㊀Xu G W.Modern Practical Gas Chromatography.Beijing:Chemical Industry Press(许国旺.现代实用气相色谱法.北京:化学工业出版社),2004:246[13]㊀Gaines R B,Frysinger G 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脂肪酸的提取
提取方法主要有Bligh—Dyer法及Folch法。
前者适用于大量脂类的提取，提取率在95％甚至更高；后者适用于少量组织内脂的提取，提取率在95％～99％。
我们在实验中常用Folch法。
称取1 g待测样品，加入10 ml甲醇，加少量酸洗砂研磨，匀浆1 min，然后加入20 ml氯仿，继续匀浆2 min，过滤，滤渣中加入氯仿一甲醇混合液(2：1 V／V)30 ml 并研磨，过滤。
先用20 ml氯仿及10 ml甲醇洗涤滤渣，合并滤液，然后加入全部滤液体积1／4的水，振荡，静置分层，将上层及界面处固体物吸除去，然后加入甲醇一水混合物(1：1)，体积为下层体积的1／4，振荡，静置分层，吸掉上层液体及界面物，重复洗涤两次。
然后将有机相减压蒸干，配制成氯仿溶液，一20℃下保存。
注意：在分析植物组织中的脂质时，需要用加热法使植物中的脂酶失活。
1．皂化、酯化取约4 mg的总脂按Carreau—Dubacq法，加入约1 ml 1．5％的NaOH／MeOH(或1％Na／MeOH)溶液，在55。
C水浴中加热30 min，然后加入1．5 ml HCl／MeOH，水浴加热30 min，加0．5 ml左右的蒸馏水，然后用4 ml／Eg烷萃取，吸取正己烷层，重复两次。
然后将萃取液减压蒸干，加入0．3 ml氯仿。
Modified Folch procedureHomogenised tissue (10 g) was progressively added tosmall amounts of a chloroform/methanol 2:1 (v/v) mixture(up to 200 ml), with vigorous shaking, and then theextraction was carried on for a further 2h, using anelectromagnetic stirrer. The mixture was filtered and thefilter was re-washed with fresh solvent and pressed.Fifty millilitres of 0.88% potassium chloride were addedand the mixture was shaken. The aqueous layer (upper)was removed by aspiration and the washing procedurewas repeated. The extract was then dried by addinganhydrous sodium sulphate, which was filtered again,before the solvent was removed using a rotary evaporator. The extract was then placed in a desiccatorovernight and weighedExtraction by acid hydrolysisHomogenised tissue (10 g) was progressively added to small amounts of a chloroform/methanol 2:1 (v/v) mixture (up to 200 ml), with vigorous shaking, and then the extraction was carried on for a further 2h, using an electromagnetic stirrer. The mixture was filtered and the filter was re-washed with fresh solvent and pressed.Fifty millilitres of 0.88% potassium chloride were added and the mixture was shaken. The aqueous layer (upper) was removed by aspiration and the washing procedure was repeated. The extract was then dried by adding anhydrous sodium sulphate, which was filtered again, before the solvent was removed using a rotary evaporator. The extract was then placed in a desiccatorovernight and weighedExtraction by ASE。
脂肪酸抽提方法
脂肪酸抽提方法抽提步骤：（1）刮菌：将菌在216L平板上活化划出单菌后，挑单个菌落转接到Marine Agar 培养基（BD；Difco；Ref：212185），28℃避光培养48 h 左右（有一定浓度，且较为新鲜），用灭菌的长牙签将菌落刮取到脂肪酸测定管的底部，菌的湿重不得少0.4 g；（也可将鲜菌冻干后，直接称取0.02g到测定管内）（2）皂化：加入1mL 试剂1 于测定管内，充入氮气5-10s后将管盖拧紧，涡旋振荡20 s；将测定管放入超声破碎仪内超声处理10 min，再充分振荡后放入100 ℃水浴锅内加热处理25 min；每隔5min取出振荡5-10s；处理结束后放入凉水中快速冷却；（3）甲基化：在测定管内加入2 mL 试剂2，迅速将管盖拧紧（反应将生成挥发性物质），涡旋振荡20s；80 ℃水浴10 min ；处理结束后放入凉水中快速冷却；（4）萃取：在测定管内加入1.25 ml的试剂3，将管盖拧紧，涡旋振荡10 min，使萃取更充分；静置3-5 min 待溶液分层后，用干燥洁净的玻璃吸管将下层溶液吸取掉，保留上层液相；（5）洗涤：在上述溶液中加入3mL 试剂4，将管盖拧紧，涡旋振荡3-5 min，静置10-15 min使溶液分层，（对于久置后仍不能分层的样品，则加入500μL的饱和NaCl溶液，振荡后再静止使其分层）用玻璃吸管取约2/3的上清加入GC 瓶内；盖紧瓶盖，脂肪酸样品制备完成。
附录：试剂1：NaOH 45g (certified ACS)甲醇150mL (色谱纯)ddW 150mL试剂2：HCl 325mL ( 6 mol/L )甲醇275mL （色谱纯）试剂3：正己烷200mL （色谱纯）甲基叔丁基醚200mL （色谱纯）试剂4：NaOH 10.8 g (certified ACS)ddW 900mL饱和NaCl溶液：NaCl40g (certified ACS)ddW 100mL。
脂肪酸测定步骤
细胞脂肪酸组成分析Sherlock Microbial Identification System(MIS)就是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作安全、简单、快速，实验成本也相对较低。
它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1 100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2 200种。
一、仪器设备安捷伦6 890N气相色谱、Sherlock MIS系统、旋转式混合振荡仪、水浴锅、XW．80A旋涡混合器、10 IIll带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶等。
所有的玻璃器皿均需在马福炉中400~C烘烤1 h。
二、培养基MIDI推荐培养基--TSBA培养基：加热混合溶解30 g胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptiease soy broth，TSB)、15 g琼脂(Granulated ar)和1 L去离子水制成。
三、配置试剂（所有有机试剂均为HPLC级，无机试剂均为优级纯）溶液I（皂化试剂）：混合150 ml水和150 ml甲醇，加入45 g NaOH，同时搅拌至完全溶解。
溶液II（甲基化试剂）：325 ml 6 mol L 的盐酸加入到275 ml甲醇中，混合均匀。
溶液III（萃取试剂）：加200 ml甲基叔丁基醚到200 ml正己烷中，混合均匀。
溶液IV（碱洗液）：在900 ml去离子水中加入10.8 gNaOH，搅拌至完全溶解。
溶液V（饱和NaC1溶液）：在100 ml去离子水中加入40 g NaC1。
四、实验方法试验方法主要参照MIDI操作手册，即在培养基上28℃恒温培养细菌24 h后取菌，通过提取和分离细菌细胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFA)，甲基化后进行气相色谱鉴定分析。
瘤胃液、血液中脂肪酸GC测定前处理方法
瘤胃液、血液中脂肪酸的测定方法1.试剂1.1. NaOH/Methanol（氢氧化钠甲醇溶液）：将2g氢氧化钠溶于100ml甲醇中，溶液放置一段时间后，可能产生碳酸钠白色沉淀而失效，此时重新配制。
溶液冷藏保存。
1.2. 盐酸/甲醇溶液：10ml乙酰氯慢慢加入到100ml无水甲醇中，冷藏保存。
1.3. Na2SO4溶液6.67g Na2SO4溶于100ml纯水中。
1.4. 正己烷/异丙醇混合溶液正己烷/异丙醇以3：2体积比例混合，冷藏保存。
1.5. 内标：内标（C17:0）0.05g溶解在10ml正己烷中，在冷藏状态下保存。
1.6. 正己烷使用色谱纯。
2.仪器高速离心机水解管氮吹仪恒温水浴锅气相色谱仪（FID检测器）3.操作步骤①萃取：用移液管取3ml瘤胃液样品或1ml血浆置于10ml水解管中，加入5ml 正己烷/异丙醇（3：2，v/v）混合液，轻轻晃动30s。
②吹干：在氮吹仪上用氮气将样品上层液吹干。
③加入0.5ml正己烷和1ml甲醇。
④碱酯化：向吹干的水解管中加入3ml氢氧化钾甲醇溶液，在50℃恒温水浴锅中水浴15min。
⑤酸酯化：向碱酯化完全的水解管中加入3ml盐酸甲醇溶液，拧紧盖子，在90℃恒温水浴锅中水浴120min。
⑥取出冷却到室温，3ml水和5.0ml正己烷，震荡，静置分层。
⑦吸取上层液体，定容10ml，加1g左右的无水NaSO4,干燥后可上机测定。
4.注意事项样品分析过程中每一步均要求混合均匀，但又不能剧烈震荡；有机层的转移须尽量完全；水浴过程中不停地检测试管是否密封完全，防止漏气，造成酯化不完全。
GC-FID内标法测定植物提取物中脂肪酸含量的方法研究
1.1 原料与试剂 植物提取物样品 ：花椒提取物、番茄提取
物和辣椒提取物（晨光生物科技集团股份有限 公司）。
甲醇（色谱纯，Fisher）；正庚烷（色谱纯， 天津市光复科技发展有限公司）；氯化钠（分析 纯， 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 ）； 无 水 硫酸钠（分析纯，中天精细化工有限公司）；氢 氧 化 钠（ 分 析 纯， 天 津 市 永 大 化 学 试 剂 有 限 公 司 ）； 三 氟 化 硼 - 甲 醇 溶 液（15%， 麦 克 林 ）； 十一碳酸甲酯（纯度大于 98%，日本 TCI）；37 种脂肪酸甲酯混标（单一成分 0.1 ～ 0.6mg/mL， Supelco）。 1.2 仪器设备
（1. Hebei Chenguang Detection Technology Services Co.，Ltd，Handan 056000； 2. Chenguang Biotechnology Group Co.，Ltd.，Handan 057250；
3. Hebei Plant Natural Pigment Industry Technology Research Institute，Handan 057250）
Study on the determination of fatty acids in plant extracts by GC-FID internal standard method
HAN Jie1，YANG Qingshan1，*，WANG Wenchang1，ZHANG Xiaofang1， GAO Huiyuan1，CHENG Yuanxin2，3，SONG Lijuan1
摘 要 ：采用气相色谱仪建立了操作简单、检测用时短、成本低的脂肪酸含量检测方法，经验证该方法
脂肪酸 溶剂浸提法
脂肪酸溶剂浸提法脂肪酸溶剂浸提法是一种常用的分离和提取脂肪酸的方法。
本文将介绍脂肪酸溶剂浸提法的原理、步骤和应用。
脂肪酸是一类重要的有机化合物，广泛存在于动植物的脂肪组织中。
脂肪酸在生物体内起着重要的能量储存和传递的作用，并参与调节许多生理过程。
由于脂肪酸在生物体内的重要性，研究人员对其进行提取和分离的方法进行了深入研究，脂肪酸溶剂浸提法就是其中一种常用的方法。
脂肪酸溶剂浸提法的原理是利用溶剂的性质将脂肪组织中的脂肪酸从其他组分中分离出来。
常用的溶剂有乙醇、氯仿、正己烷等。
这些溶剂能够与脂肪酸形成可溶性的复合物，从而实现脂肪酸的提取和分离。
脂肪酸溶剂浸提法的步骤如下：1. 样品准备：将含有脂肪酸的样品（例如动物脂肪、植物油等）进行粉碎和干燥，以便提高提取效果。
2. 溶剂选择：根据样品的性质和需求，选择适当的溶剂进行提取。
常用的溶剂有乙醇、氯仿、正己烷等。
3. 浸提：将样品与溶剂进行充分混合，通常采用浸泡或搅拌的方式，使溶剂与样品充分接触，提高提取效果。
4. 分离：将浸提得到的混合物进行过滤或离心，将溶剂中的脂肪酸分离出来。
可以使用滤纸或离心机进行分离。
5. 蒸发：将得到的脂肪酸溶液进行蒸发，去除溶剂，得到纯净的脂肪酸。
脂肪酸溶剂浸提法在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。
在食品工业中，脂肪酸溶剂浸提法用于提取植物油中的脂肪酸，用于生产食用油和植物油副产物的加工。
在医药领域，脂肪酸溶剂浸提法用于提取药物中的活性成分，以及制备药物载体。
在化妆品领域，脂肪酸溶剂浸提法用于提取植物油中的脂肪酸，用于制备天然的基础油和护肤品。
脂肪酸溶剂浸提法是一种常用的分离和提取脂肪酸的方法。
通过选择适当的溶剂，将脂肪酸从样品中提取出来，可以应用于食品、医药和化妆品等领域。
脂肪酸溶剂浸提法的原理简单，步骤清晰，是一种非常有效的提取方法。
脂肪酸值的测定
脂肪酸值的测定一﹑实验原理脂肪酸溶于有机溶剂，通常利用无水乙醇来萃取样品中的脂肪酸，然后用标准氢氧化钾溶液滴定。
从而求得脂肪酸值。
二、仪器和试剂1．试剂0.01mol/L KOH或（NaOH）乙醇 -（95%）溶液；先配置约0.5 mol/L KOH，标定，然后用移液管移取10ml,用95%乙醇稀释至500ml.无水乙醇95%乙醇1g/100ml酚酞乙醇溶液：1.0g酚酞溶于100ml95%乙醇溶液中。
2．仪器具口磨口塞锥形瓶 150ml 、25ml比色管、10ml移液管、50ml移液管、微量袖滴定管、表面皿、感量0.01g天平、漏斗、电动振荡器三、操作步骤１．试样制备从平均样品中分取样品约80g，粉碎，95%粉碎试样通过0.45mm孔径筛。
２．浸出，取试样10g±0.01g于150ml具塞锥形瓶中，加入50ml无水乙醇，加塞，振荡几秒后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置电动振荡器振荡10min，将锥形瓶倾斜静置数分钟，让试样粉粒沉降在一角。
３．过滤：小心地倾析尽可能多的上清液于铺在玻璃漏斗上的多折滤纸中，用表面皿盖在漏斗上，以减少蒸发，弃去最初几滴滤液后，用25ml比色管准确收集滤液25ml。
４．滴定：将25ml滤液移入锥形瓶中，用50ml无二氧化碳蒸镏水分三次洗涤比色管，将洗涤液一并倒入锥形瓶中，加几滴酚酞批示剂，立即用0.01mol/LKOH-乙醇溶液滴定至呈现微红色，0.5min内不消失为止，记下所耗氢氧化钾乙醇溶液毫升数（V O）。
四、结果计算脂肪酸值按公式计算50 100X（脂肪酸值）=（V1- V0）c×56.1××25 m(100－M)式中：X----每100g干样所耗氢氧化钾的毫克数，mgV1----滴定试样用去的氢氧化钾乙醇溶液体积，mlV0----滴定25ml酚酞乙醇溶液用去氢氧化钾乙醇溶液的体积，ml50----浸泡试样用无水乙醇的体积，ml25----用于滴定的滤液体积，mlc-----氢氧化钾（或氢氧化钠）-乙醇溶液的浓度，mol/Lm-----试样质量，g56.1---1ml浓度为1mol/L的碱液相当KOH的质量，mgM-----试样水分百分率，%（测定小麦粉、玉米粉脂肪酸值时按湿基计算，不必减去水分）100----换算为100g试样质量双试验结果允许差为每100g干样所耗氢氧化钾不超过2mg，求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位。
862-MIDI微生物鉴定(脂肪酸分析)系统PLFA 应用案例及其它
PCA（Principal Component Analysis ）原理
多样本多维分析（以脂肪酸为维）
二维界面显示 （ex. PC1 vs. PC2）
最大程度展示系统变异（PC1>PC2>……)
当累计方差贡献率大于80%，可全面反映系统变异
样本固有性质在反映变异情况的二维主成分界面上得以展 现，由其本身性质决定丛集或分离。
PLFA应用领域有哪些？
MIDI PLFA方法研发中！ （预计3月底完成第一2天 GC分析时间：15min 2小时）
Байду номын сангаас
PLFA专用标准品
≈$2000
PLFA研究案例分析
文献标题： The effects of mineral fertilizer and organic manure on soil microbial community and diversity
关于配置
2011年MIDI发布最新GC配置，已转发大家，请 注意更新 安捷伦提供电脑默认为WIN7系统，与MIDI不兼 容。建议自购电脑或提前告知安捷伦销售更改发 货电脑系统。
谢 谢！
有问题吗？欢迎讨论
小测试：
MIDI相对GC-MS在PLFA分析中有哪些优势？
Biolog在群落分析中的局限主要是什么？ MIDI在微生物鉴定中的优势及弱势 MIDI软件安装的操作系统局限
应用范围
指示环境因素变化对微生物群落变化的影响（包含菌根 共生，植物与微生物相互作用）
领域细分
食品中脂肪酸的测定
食品中脂肪酸的测定基础知识：油脂是食品的重要组分和营养成分。
油脂中脂肪酸组分的测定最常用的方法是气相色谱法。
样品前处理采用酯交换法（甲酯化法），图谱解析采用归一化法。
气相色谱(GC) 是一种把混合物分离成单个组分的实验技术它被用来对样品组分进行鉴定和定量测定。
一个气相色谱系统包括：• 可控而纯净的载气源能将样品带入GC系统• 进样口同时还作为液体样品的气化室• 色谱柱实现随时间的分离• 检测器当组分通过时检测器电信号的输出值改变从而对组分做出响应• 某种数据处理装置氢火焰离子化检测器(FID) ：氢气和空气燃烧所生成的火焰产生很少的离子。
在氢火焰中，含碳有机物燃烧产生CHO+离子，该离子强度与含量成正比。
该检测器检出的是有机化合物，无机气体及氧化物在该检测器无响应。
当纯净的载气（没有待分离组分）流经检测器时产生稳定的电信号就是基线。
1——载气(氮气)；2——氢气；3——压缩空气；4——减压阀(若采用气体发生器就可不用减压阀)；5——气体净化器(若采用钢瓶高纯气体也可不用净化器)；6——稳压阀及压力表；7——三通连接头；8——分流／不分流进样口柱前压调节阀及压力表；10——尾吹气调节阀；11——氢气调节阀；12——空气调节阀；13——流量计(有些仪器不安装流量计)；14——分流／不分流进样口；15——分流器；16——隔垫吹扫气调节阀；17——隔垫吹扫放空口；18——分流流量控制阀；19——分流气放空口；20——毛细管柱；21——FID检测器；22——检测器放空出口；方法来源：GB 5009.168-2016 食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定1、范围本方法规定了食品中脂肪酸含量的测定方法。
本方法适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品的脂肪酸含量测定。
2、原理样品中的脂肪酸经过适当的前处理（甲酯化）后，进样，样品在汽化室被汽化，在一定的温度和压力下，汽化的样品随载气通过色谱柱，由于样品中组分与固定相间相互作用的强弱不同而被逐一分离，分离后的组分到达检测器（detceter）时经检测口的相应处理（如FID的火焰离子化），产生可检测的信号。
MIDI微生物鉴定脂肪酸分析系统PLFA应用案例及其它
谢 谢！
有问题吗优势 一步鉴定到株型(菌库中已有菌株），亲缘性分析 可分型
弱势 肠道菌（遗传高度相关）鉴定准确性为属级，推 荐使用碳源利用鉴定法
关于配置
2019年MIDI发布最新GC配置，已转发大家，请 注意更新
安捷伦提供电脑默认为WIN7系统，与MIDI不兼 容。建议自购电脑或提前告知安捷伦销售更改发 货电脑系统。
PLFA混合样本分析 根据不同类群微生物的指示性PLFA不同, 通过提取和分 析指示性PLFA , 测定其含量, 可定量反映活体微生物中不 同类群的生物量及总生物量。
应用范围
指示环境因素变化对微生物群落变化的影响（包含菌根 共生，植物与微生物相互作用）
领域细分
环境与资源科学 农林牧渔科学 植物与土壤科学 海洋、水文/水利、河流/湖泊科学 生态与环境保护科学
MIDI微生物鉴定脂肪酸分析系统PLFA应用案例及其它
PLFA分析原理
PLFA定义 PLFA 是磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid) 的英文 缩写。PLFA 是构成活体细胞膜的重要组分
群落分析基本原理 部分PLFA 总是出现在同一类群的微生物中, 而在其它类 群的微生物中很少出现
其他群落分析方法
DNA测序（STS-PCR（sequence-tagged site） +T-RFLP/DGGE/TGGE；二代测序仪，100万条 序列/次）
Boilog法（碳源代谢差异）
PLFA分析优势： 灵敏度、准确性（SD小）；取样便利，保真性； 工作量；成本（二代测序10万RMB/次）
MIDI在PLFA中的优势
MIDI 提取及分析方法由于低成本、其简单性、 可同时处理大量样品而被广泛应用于土壤微生物 群落研究
提取和纯化动物组织中的脂肪酸
提取和纯化动物组织中的脂肪酸脂肪酸是一类重要的有机化合物，它们在动物体内起着重要的生理功能，如提供能量、构建细胞膜以及合成信号分子等。
提取和纯化动物组织中的脂肪酸对于了解其组成和功能具有重要意义。
本文将介绍一种常用的方法以及操作步骤，来提取和纯化动物组织中的脂肪酸。
材料与试剂准备- 动物组织样品（如肝脏、脂肪组织等）- 甲醇（HPLC级）- 氮气或氩气- 乙酸乙酯（HPLC级）- 热水浴- 玻璃离心管- 液体-液体萃取仪（如分液漏斗）- 无水硫酸钠- 无水氯化钠- 无水氯化镁- 熔点试管操作步骤1. 组织样品的制备a. 准备动物组织样品，如肝脏或脂肪组织，并将其切碎以增加提取效率。
b. 将组织样品放入玻璃离心管中，并加入适量的甲醇，使其完全覆盖组织样品。
c. 将玻璃离心管放入冰水混合物中，在低温下均匀震荡离心管至少30分钟以实现脂肪酸的萃取。
2. 脂肪酸的提取与纯化a. 准备液体-液体萃取仪，将乙酸乙酯置于漏斗中。
b. 将步骤1中的甲醇提取液转移至漏斗中并加入等体积的乙酸乙酯。
注意，使用无水乙酸乙酯可以获得更好的提取效果。
c. 轻轻摇动漏斗，使两个相互溶解的液体充分混合，形成两相体系。
d. 等待两相液分离，通常需要约15分钟。
分离后，底部的有机相富集了大部分的脂肪酸。
e. 将有机相（乙酸乙酯层）转移到一个干燥的玻璃离心管中。
f. 加入适量的无水硫酸钠，用于吸附水分，然后轻轻摇动离心管混合。
g. 将离心管置于离心机中进行离心分离。
分离后，上层的乙酸乙酯中将只包含纯化的脂肪酸。
h. 仔细将上层的乙酸乙酯转移至一个干燥的熔点试管中。
i. 加入一小撮无水氯化钠和无水氯化镁，用于吸附任何残余水分。
j. 将试管放入热水浴中，加热并用玻璃棒搅拌以去除乙酸乙酯中的残余水分。
注意，不要加热过量以避免脂肪酸的降解。
k. 待试管中的液体完全干燥后，即得到纯化的脂肪酸。
结果与讨论通过上述步骤，我们可以提取和纯化动物组织中的脂肪酸。
MIDI脂肪酸提取步骤
培养皿的建议划线法(Streaking plates)利用Sherlock MIS 鉴定微生物时，建议使用Array四区划线法(Quadrant streak pattern) (图2-2)，在该模式中，第四区有单克隆生长，以确认是否是纯培养，第三区菌落生长处于对数后期(Late Log)。
图2-2-四区画线式样(Quadrant streak pattern)从分离培养皿中选择分离良好的单克隆进行划线。
接种环采用火焰灭菌，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。
用无菌冷却的接种环挑取菌落，移至另一个新的培养皿中。
划第一区时全部的接种环都与培养基接触，所以此区域为稠密的接种培养；第二区转动接种环90°角，并且用接种环边划过第一区的角落二次，如图表的划法，连续划平行线，不再利用第一区。
接种第三区时，将接种环转动90度角并通过第二区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第二区。
灭菌及冷却你的接种环，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。
接种第四区时，利用转动接种环90度角并通过第三区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第三区。
这种划线方式提供了充足的材料以供分析，同时能确认所得的细菌是纯培养物。
培养条件(Incubation)大多数稳定的脂肪酸成份是从培养的对数后期（late log）中生成的。
Sherlock数据库构建时也多数选择在此培养条件下微生物。
下述的标准培养条件状况也符合多数实验室的习惯。
所使用例外的注意事项在实验室的列表在Appendix B。
选用小容积高质量的培养箱，使得生长条件可以得到良好的控制。
培养箱过大或者大量样品共用培养箱可能难以维持良好的生长条件。
不要在培养箱中残留任何消毒药剂，因为这些药剂即使在空气中只有低浓度残留，也可能影响微生物的生长。
好氧菌培养条件(Aerobic Incubation)标准的好氧菌(TSBA 50)培养性况如下:z培养温度28 ±1℃z培养时间24 ±2小时临床的好氧菌(CLIN 40)则要求的培养温度为35±1℃。
脂肪酸检测原理及方法
按营养角度分类
非必需脂肪酸：是机体可以自行合成，不必依靠食物供应 的脂肪酸,它包括饱和脂肪酸和一些单不饱和脂肪酸。
必需脂肪酸：为人体健康和生命所必需，机体自己不能合 成,必须依赖食物供应，它们都是不饱和脂肪酸,均属于 ω3族和ω-6族多不饱和脂肪酸。如亚油酸，亚麻酸。必需脂 肪酸不仅为营养所必需，而且与儿童生长发育和成长健康 有关，更有降血脂、防治冠心病等治疗作用，且与智力发 育、记忆等生理功能有一定关系。
甲酯化
收集全部细胞后，用PBS洗涤3次（4000rpm，5min），加 入2 ml的2.5%（V/V）的硫酸/甲醇溶液，80 ℃恒温过夜； 冷却至室温后，加入1 mL 1mg/mL的内标（C19:0），再 加入2 mL饱和KCl溶液，然后正己烷抽提脂肪酸甲酯，抽 提两次每次2 mL，将脂肪酸甲酯萃取到有机相。分别将 两次获得的脂肪酸甲酯的正己烷溶液转入新的10 mL离心 管中，经氮气吹干后重新加入500μL正己烷重新溶解， 20℃保存。
脂肪酸的检测方法
气相色谱法（GC）
1952年, James和Martin发明了气相色谱法，同年获得诺贝尔化学奖。 气相色谱法又称气相层析法，是一种采用冲洗法的色谱分离技术, 特 别适用于生化产品的分离纯化。 原理：气相色谱以气体作为流动相，用固体吸附剂或液体作固定相， 它利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定液液相间的分配系数不 同，当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两 相间进行反复多次的分配(吸附- 解吸附或溶解- 放出) ，由于固定相 对各组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度 就不同，经过一定的柱长后，试样中被分离的各组分即能达到完全分 离。目前单纯的气相色谱应用相对要少些，一般是与其他技术联用。 （Agilent 7890A） 单纯用气象色谱法检测时因其不能对所检测物质定性检测所以检测时 样品要加入内标，或用外标矫正。
很专业的磷脂脂肪酸提取步骤
方法一：1) 取5 g（精确至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mL Bligh-Dyer 提取液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜。
3) 4000 r/min 室温离心10 min，用无菌一次性吸管小心吸掉上清液，下层用滤纸过滤至锡纸包裹的小三角瓶中，高纯氮气吹干。
4) 用氯仿冲洗小柱，将活化后的硅胶（事先在105℃烘干1h，冷却至室温）加一定量的氯仿浸泡，用胶头吸管吸入柱中，注意滴加过程要缓慢，不要产生气泡，并保持柱子液面水平，上层氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸，底部连接橡皮管，并用夹子旋紧静置1~2h。
5) 待柱子稳定后再用氯仿小心重洗柱子，在样品三角瓶中加300 μL 氯仿溶解样品，用吸管转移至柱中，分别用10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 无水甲醇对样品进行洗脱，加无水甲醇后，开始用试管接收样品，并用高纯氮气吹干。
6) 往试管中加1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和1 mL 0.2 mol/L 氢氧化钾甲醇溶液，37℃，水浴15 min。
7) 再加0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和2 mL 灭菌去离子水，振荡分离，静置1 h 分层。
8) 将上层小心转移至另一试管中，高纯氮气吹干，9) 加入2 mL 含33 μg/mL 内标十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester）的有机溶剂正己烷，用注射器经有机相滤膜过滤后注入样品瓶，上机待测。
方法二：1) 取5 g（称准至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mL Bligh-Dyer 提取液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 将上清转移至新的用锡箔纸包裹的离心管中，加入7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，混匀，4℃静置过夜；3) 4000 r/min 离心10 min，收集下层溶液，合并两次的下层溶液；4) 剩下步骤同方法一3）~9）方法三：1) 取5 g（称准至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mLBligh-Dyer 提取液，离心管用锡纸包裹，250 r/min 振荡提取2 h；2) 2000 r/min 离心10 min，上清转移至以新的用锡箔纸包裹的离心管中。
脂肪酸值测定方法改良
脂肪酸值测定方法改良脂肪酸值测定方法改良文章标题：改良脂肪酸值测定方法步骤详解引言：脂肪酸值测定方法是分析食品和生物样品中脂肪酸含量的重要手段。
为了提高测定的准确性和效率，我们对传统的脂肪酸值测定方法进行了改良。
本文将详细介绍改良后的测定方法的步骤。
第一步：制备样品1. 选取代表性样品，如食用油、肉类或乳制品等。
2. 将样品粉碎或搅拌均匀，确保样品内脂肪酸的均匀分布。
第二步：提取脂肪酸1. 取适量的样品，将其加入提取溶剂中，如正己烷/异辛烷混合溶剂。
2. 使用超声波浴或其他适当的方法，将样品与溶剂充分混合。
3. 进行离心分离，将上清液收集到一个新的离心管中。
第三步：甲酸酯化反应1. 取适量的上清液，加入甲酸和硫酸甲酯催化剂。
2. 将混合物进行加热，通常在60-70°C反应2-3小时，使样品中的脂肪酸与甲酸形成甲酸酯。
3. 冷却混合物至室温。
第四步：提取甲酸酯1. 加入适量的无水氯化钠溶液，使甲酸酯与水相分离。
2. 轻轻摇匀混合物，并离心分离，收集上清液。
第五步：洗涤和浓缩1. 加入适量的碳酸钠溶液，用来中和残留的酸性物质。
2. 使用无水氯化钠溶液进行反复洗涤，以去除杂质和离子。
3. 使用旋转蒸发仪将洗涤后的上清液浓缩至干燥。
第六步：衍生化1. 加入适量的二氯甲烷和硫酸氢钠，进行衍生化反应。
2. 用氮气吹干样品，直到蒸发至干燥。
第七步：气相色谱分析1. 将样品溶解于适量的溶剂中，如己烷。
2. 使用气相色谱（GC）仪器进行分析，选择适当的柱和检测器，如化学电离检测器（FID）。
3. 根据脂肪酸的保留时间和峰面积，计算样品中各种脂肪酸的含量。
结论：通过对传统脂肪酸值测定方法的改良，我们成功地提高了测定的准确性和效率。
这一改良方法可以在食品安全和营养研究中得到广泛应用，为相关领域的进一步研究提供了有力的支持。
脂肪酸值测定方法
脂肪酸值测定方法
脂肪酸值的测定方法主要包括以下步骤：
1. 样品提取：称取适量样品，加入适量的甲醇/CH2Cl2（1:3）混合溶液，
摇匀后进行超声抽提。
取出离心管进行离心，收集上清液，重复几次，直至萃取完成。
2. 皂化：在萃取液中加入适量的碱溶液（如6%KOH的甲醇溶液），进行
碱水解。
然后加入正己烷进行萃取，弃去上层正己烷萃取液，重复几次，直至皂化完成。
3. 衍生化：将上述萃取液转移到带盖玻璃管中，用氮气吹干后，加入适量的衍生化试剂（如BF3-MeOH），密闭后在一定温度下加热一段时间。
待样
品冷却后，加入适量的盐溶液，用正己烷萃取，转移至进样瓶中，氮气吹干，待分析。
4. 色谱分析：在气相色谱仪上进行色谱分析，使用合适的色谱柱、升温程序、进样口温度等条件，测定样品中脂肪酸的值。
5. 结果计算与评价：根据色谱图中的峰面积或峰高，计算脂肪酸值。
可以使用外标法或内标法进行计算。
最后对结果进行评价，与标准值或参考值进行比较，评估样品的品质和安全性。
请注意，在进行脂肪酸值测定时，需要注意样品的保存和实验操作的准确性，以保证结果的可靠性和准确性。
同时，具体的操作步骤和试剂使用量等参数需要根据实验要求和实际情况进行调整。
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TSBA培养基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6数据库)Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培养基是嗜氧菌标准的培养基。
利用以下的配方作为TSBA培养基。
供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。
●混合在2升的锥形瓶●加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解●在温度121度及15psi下高压灭菌15分钟注意事项：不可过度加热培养基，使用高压灭菌器须有温度及时间的设定装置。
●在水浴中冷却至60度●加20-25 ml在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌100 x 15mm直径的培养皿中，琼脂须有2.5-3.2mm深。
●允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌装置中。
它们可以保存在冷藏中直到使用。
注意事项——关于商业化已备好的TSBA培养基：TSBA可以从BBL购买，但需要指定货号，见附加数据(Appendix A)。
使用其它供应商提供的TSBA培养基可能会导致结果不一致，用户需要用ATCC菌株验证培养基是否效果相当。
试剂的准备 (Reagent Preparation)四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和基本洗涤脂肪酸的萃取物。
试剂应准备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。
放置一个Teflon-coated搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。
只有Teflon和玻璃可以接触到试剂。
瓶子可以重新使用不须要重新浸润。
自动分注的增加备置速度但是必须准备和确定适当的操作在每批样品使用前。
确认分注试剂使用分注试剂在有刻度的量筒以达到校正效果。
以下的配方准备试剂约够300个样品或许可以在先前调整以够配合实验室的样品量，试剂准备用VPI Anaerobe Method 和数据库在Appendix B 中。
注意事项: 试剂1和4是腐蚀性和试剂2是酸性的全程配戴安全眼镜及手套，hexane 及methyl-tert-butyl ether (MTBE)在试剂3是可燃性的。
熄灭所有的火焰或热源在使用前操作在一个化学性的抽气风盖之下。
试剂1-皂化试剂 (Ragent 1: Saponification Reagent)●混合水和methanol 加入NaoH小球到溶剂中同时搅拌至锭剂完全溶解试剂2-甲基化试剂 (Reagent 2: Methylation Reagent)●加酸液至methanol中搅拌注意事项: 盐酸(Hydrochloric Acid)必须有保证浓缩。
只有盐酸运送在玻璃瓶中是被允许的，和你的供给商讨论包装的信息，请参考供给的建议在Appendix A如果6.00N HCI无法取得资询你的制造商标示浓度在那批号上确认最终6.00N的溶液滴定对比一个标准基础溶液。
试剂3-萃取溶剂 (Reagent 3: Extraction Solvent)●加入MTBE 在hexane 中并搅拌均匀试剂4-碱洗涤 (Reagent 4: Base Wash)●加入NaOH在水中同时搅拌至完全溶解额外的试剂 (Additional Reagents)●Saturated NaCl:溶解40g 的ACS NaCl 在100ml的去离子水中试剂的保存及有效期限 (Reagent Storage and Shelf Life)建议每30天泡制新的试剂。
可在瓶中保存在室温下使用Teflon-lined盖子。
储存移吸管在干净的容器中。
所有试剂必须标示完全包括配制日期和过期日为一个月，纯净的试剂必须确认在准备试剂控制的空白对照组(过程不加任何组织物)在每次跑样品时。
但不使用时，移开移吸管从试剂 1 (皂化试剂)瓶和利用打气的方式润丝清洁，利用去离子水去预防抓住活塞盖上试剂瓶用一个干净的Teflon-lined 螺旋盖。
试剂3，萃取的溶剂是可燃性的和必须储在良好的化学性的抽气风盖之下或溶剂排气柜。
准备萃取: 5个基本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):每个样品放在单一试管中经过萃取的过程，每批可准备50个样品以增加方便性。
萃取过程中的每个过程都摘要显示在图2-4。
1 获菌(Harvesting)四区画线方法是被设计为稀释接种所以此四区会维持良好的分离菌落去提供操作人员判别是否为纯化菌落。
菌落必须获菌从大都稀释的区域表现汇合成长 (late log期)单独的条纹轴。
获菌这些区域典型的区块有大多取稳定的脂肪酸成份来自于接种曾被只够的稀释去引起在充足的成长的菌落不需限制的营养补给。
最佳的获菌的区域在第三区。
注意事项: 最佳的获菌区域为第三区。
成长较慢的微生物也许需要增加每次利用接种环在以下的四区划线技术通过二次增加为四至六次。
也许也可利用取第二区的微生物。
如果从培养皿中正确的区域取出微生物但会引起极差的数据库吻合，从第三区取出的微生物是最佳的；然而，如果较须生长的微生物也可从第1及2区取出。
从培养皿中取出要培养的微生物，轻括培养皿的表面利用无菌4mm接种环。
当轻微的转动接种环利用前后移动取出菌落。
一个堆积4mm接种环(约 40mg)湿重的菌落充足的原料的过程。
有些培养将不会粘着良好在金属的接种环。
塑料的接种环，Pasteur pipette融解在小的接种环，或较小直径的白线环可以用来获菌这样的培养。
确信维持相同份量的微生物相同于堆积4mm接种环提供的。
可以经由显具的总区域计数在最终的报告中或太少量的操作微生物会被判定出。
注意事项: 在下一个步骤执行前确认盖子必须完成吻合试管。
●放入接种环夹带者菌体进入一个干净，干燥13mmx100mm有螺旋盖的培养试管。
抹拭菌种脱离接种环在内底部的表面约在培养管底部约10mm的地方。
移开及无菌接种环。
●如果未做请确认培养管中有标示萃取的号码(从Extriction Log Sheet)一致性的获菌培养皿。
利用实验专用的笔直接写在玻璃上。
如果足够的先前清洁，培养管可以再使用获得微生物从每个培养皿中在每批皂化的步骤之前。
2 皂化(Saponification)强烈的甲醇基础件随着加热杀菌及溶解细菌。
脂肪酸将切割从细胞的脂质和改变到它们的钠盐。
注意事项: 利用沸腾或循环的水浴。
加热板或其它加热的方式意指不用适当的加热的转移移和温度控制在此步骤.。
图2-7-皂化步骤●注入1.0±0.1ml的试剂1，以甲醇为基础加入此次所有的样品。
●锁紧每个试管利用一个干净Telfon-lined螺旋盖子。
●震荡试管5-10秒。
●此批的所有样品试管在试管架上放入沸水或循环水石95-100℃的水浴中。
注意事项: 加热已锁紧的试管会产生压力划伤或裂缝玻璃制品能够破裂。
建议加热时利用化学安全盖或利用塑料盾。
全程穿戴安全护目镜。
●五分钟之后，从沸腾的水中移开试管并轻微的冷却它不要打开盖子，震荡每支试管5-10秒再放试管回水浴中。
●确认试管漏损,此刻是否有气泡在试管中升起为证据,再栓紧有漏的试管的盖子，如果继续发泡，样品必须在室温下回到室温的温度然后转移到新的培养试管。
●继续加热这些试管在水浴中增长到25分钟。
●皂化在水浴中总共约30分钟以后，移开和放置试管架在冷却轻拍平底去冷却。
冰水是不被建议使用的。
3 甲基化(Methylation)甲基化转换脂肪酸(as sodium salts)成甲基脂脂肪酸(fatty acid methyl esters),以增加脂肪酸的挥发性以供GC分析利用。
图2-8-甲基化步骤●开盖加入Reagent 2，2.0±0.1ml为甲基化试剂，注入每个试管。
●栓紧盖子震荡液体5-10秒。
因为过量试剂，颗粒促使加快(salt)也许含形成。
继续前进必须跟随：●水浴加热试管80℃, 10分钟。
●移开且快速冷却至室温利用一槽冷水龙头水不建议使用冰水，摇晃试管促成至冷却的过程。
注意事项:超过时间和温度在此步骤期间可以降低环丙烷抑制成份，可以变更脂肪酸的描绘和被取名的微生物。
4 萃取(Extraction)甲基脂脂肪酸移出从酸性似水部份和转移到一个有机的部份伴随着液体的萃取过程。
注意事项: Hexanel/MTBE是可燃的。
熄灭所有可燃物和当此些溶剂(solvents)为燃烧来源。
图2-9-萃取步骤●加入1.25±0.1ml 的试剂3-萃取溶剂在每个试管中。
●盖紧盖子，放此批的试管在一个实验室的旋转器及温和混合旋转10分钟。
●打开管盖，利用干净的Pasteur Pipette取出每个样品的移开及丢弃似水(下面)部位。
5. 基本洗涤(Base Wash)一种稀释基础的溶液添加到样品的前处理管中去移去自由的脂肪酸和剩余试剂从有机的萃取中。
剩余试剂将会损坏色谱分析的系统，会引起在末尾和损失氢气甲基脂脂肪酸(hydroxy fatty acid methyl esters)。
图2-10-基本洗涤步骤●加入3.0±0.21ml试剂4，基本洗涤至每个试管。
●栓紧盖子和温和地震荡试管利用旋转的方式5分钟。
●短暂约三分钟的离心在2000 rpm被建议。
当乳状液被呈现出使用两层液面的接口更清楚。
注意事项: 检试萃取试管和水温在加入试剂前。
选择地:少数滴的标准ACS等级NaCl/水溶液可添加在试管中以增加切断乳剂。
握着试管置垂直状和震荡它快速地介于在两手掌间，并且允许它停留数分钟。
萃取物移至样品小瓶(Transfer of Extract to Sample Vial)●标示样品小瓶以供萃取鉴定。
操作人员必须使用添加数目或部份的信息来自于”SampleID” 区域中来自于萃取记录单(Extraction Log Sheet)独一的协助样品瓶登入和在萃取记录单相同。
注意事项: 螺旋盖子的样品小瓶也可使用或可容易的来自于实验室供给的公司。
利用实验室专用笔去标示样品小瓶胶带标示将不可靠。
因此在样品瓶和也许操作干扰自动液体采样器瓶子夹子。
●打开每个试管的盖子，利用干净的Pasteur pipette在每个样品中，移出下层有机体约2/3从每支试管中移到干净的GC样品小瓶。
两层的液面有时会不易看见，必须小心不可取出任何似水部份(下面)部份进入自动的样品小瓶。
●定型盖子在样品小瓶上。
●确认盖子紧密在瓶上试子转动盖子当握着此小瓶。
必须闪避出粗糙扭转要求小的上方螺旋瓶子，如果太松，调整盖子加盖器具(Stop screw in the handle)和重新定型样品小瓶。
当所有的样品萃取液移至样品小瓶中，操作人员必须已经输入自动采样及开始执行样品下一章将会讨论此点。
延迟样品前置处理(Delay During Sample Preparation)理想中，样品的过程必须持续执行非中断当菌种被获菌后。
如果有必要延迟样品处理的步骤，有几个步骤是当样品可以停在那引发较少的在分析脂肪酸的影响。