GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤分解

TSBA培养基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6数据库)

Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培养基是嗜氧菌标准的培养基。利用以下的配方作为TSBA培养基。供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。

●混合在2升的锥形瓶

●加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解

●在温度121度及15psi下高压灭菌15分钟

注意事项：不可过度加热培养基，使用高压灭菌器须有温度及时间的设定装置。

●在水浴中冷却至60度

●加20-25 ml在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌100 x 15mm直径的培养皿中，琼脂须有

2.5-

3.2mm深。

●允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌

装置中。它们可以保存在冷藏中直到使用。

注意事项——关于商业化已备好的TSBA培养基：TSBA可以从BBL购买，但需要指定货号，见附加数据(Appendix A)。使用其它供应商提供的TSBA培养基可能会导致结果不一致，用户需要用ATCC菌株验证培养基是否效果相当。

试剂的准备 (Reagent Preparation)

四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和基本洗涤脂肪酸的萃取物。试剂应准备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。放置一个Teflon-coated搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。只有Teflon和玻璃可以接触到试剂。瓶子可以重新使用不须要重新浸润。自动分注的增加备置速度但是必须准备和确定适当的操作在每批样品使用前。确认分注试剂使用分注试剂在有刻度的量筒以达到校正效果。以下的配方准备试剂约够300个样品或许可以在先前调整以够配合实验室的样品量，试剂准备用VPI Anaerobe Method 和数据库在Appendix B 中。

注意事项: 试剂1和4是腐蚀性和试剂2是酸性的全程配戴安全眼镜及手套，hexane 及methyl-tert-butyl ether (MTBE)在试剂3是可燃性的。熄灭所有的火焰或热源在使用前操作在一个化学性的抽气风盖之下。

试剂1-皂化试剂 (Ragent 1: Saponification Reagent)

●混合水和methanol 加入NaoH小球到溶剂中同时搅拌至锭剂完全溶解

试剂2-甲基化试剂 (Reagent 2: Methylation Reagent)

●加酸液至methanol中搅拌

注意事项: 盐酸(Hydrochloric Acid)必须有保证浓缩。只有盐酸运送在玻璃瓶中是被允许的，和你的供给商讨论包装的信息，请参考供给的建议在Appendix A如果6.00N HCI无法取得资询你的制造商标示浓度在那批号上确认最终6.00N的溶液滴定对比一个标准基础溶液。

试剂3-萃取溶剂 (Reagent 3: Extraction Solvent)

●加入MTBE 在hexane 中并搅拌均匀

试剂4-碱洗涤 (Reagent 4: Base Wash)

●加入NaOH在水中同时搅拌至完全溶解

额外的试剂 (Additional Reagents)

●Saturated NaCl:

溶解40g 的ACS NaCl 在100ml的去离子水中

试剂的保存及有效期限 (Reagent Storage and Shelf Life)

建议每30天泡制新的试剂。可在瓶中保存在室温下使用Teflon-lined盖子。储存移吸管在干净的容器中。所有试剂必须标示完全包括配制日期和过期日为一个月，纯净的试剂必须确认在准备试剂控制的空白对照组(过程不加任何组织物)在每次跑样品时。

但不使用时，移开移吸管从试剂 1 (皂化试剂)瓶和利用打气的方式润丝清洁，利用去离子水去预防抓住活塞盖上试剂瓶用一个干净的Teflon-lined 螺旋盖。

试剂3，萃取的溶剂是可燃性的和必须储在良好的化学性的抽气风盖之下或溶剂排气柜。

准备萃取: 5个基本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):

每个样品放在单一试管中经过萃取的过程，每批可准备50个样品以增加方便性。萃取过程中的每个过程都摘要显示在图2-4。

1 获菌(Harvesting)

四区画线方法是被设计为稀释接种所以此四区会维持良好的分离菌落去提供操作人员判别是否为纯化菌落。菌落必须获菌从大都稀释的区域表现汇合成长 (late log期)单独的条纹轴。获菌这些区域典型的区块有大多取稳定的脂肪酸成份来自于接种曾被只够的稀释去引起在充足的成长的菌落不需限制的营养补给。最佳的获菌的区域在第三区。

注意事项: 最佳的获菌区域为第三区。

成长较慢的微生物也许需要增加每次利用接种环在以下的四区划线技术通过二次增加为四至六次。也许也可利用取第二区的微生物。如果从培养皿中正确的区域取出微生物但会引起极差的数据库吻合，从第三区取出的微生物是最佳的；然而，如果较须生长的微生物也可从第1及2区取出。

从培养皿中取出要培养的微生物，轻括培养皿的表面利用无菌4mm接种环。当轻微的转动接种环利用前后移动取出菌落。

一个堆积4mm接种环(约 40mg)湿重的菌落充足的原料的过程。有些培养将不会粘着良好在金属的接种环。塑料的接种环，Pasteur pipette融解在小的接种环，或较小直径的白线环可以用来获菌这样的培养。确信维持相同份量的微生物相同于堆积4mm接种环提供的。可以经由显具的总区域计数在最终的报告中或太少量的操作微生物会被判定出。

注意事项: 在下一个步骤执行前确认盖子必须完成吻合试管。

●放入接种环夹带者菌体进入一个干净，干燥13mmx100mm有螺旋盖的培养试管。抹拭菌

种脱离接种环在内底部的表面约在培养管底部约10mm的地方。移开及无菌接种环。

●如果未做请确认培养管中有标示萃取的号码(从Extriction Log Sheet)一致性的获菌培

养皿。利用实验专用的笔直接写在玻璃上。如果足够的先前清洁，培养管可以再使用获得微生物从每个培养皿中在每批皂化的步骤之前。

2 皂化(Saponification)

强烈的甲醇基础件随着加热杀菌及溶解细菌。脂肪酸将切割从细胞的脂质和改变到它们的钠盐。

注意事项: 利用沸腾或循环的水浴。加热板或其它加热的方式意指不用适当的加热的转移移和温度控制在此步骤.。

图2-7-皂化步骤

●注入1.0±0.1ml的试剂1，以甲醇为基础加入此次所有的样品。

●锁紧每个试管利用一个干净

Telfon-lined螺旋盖子。

●震荡试管5-10秒。

●此批的所有样品试管在试管架上放入沸水或循环水石95-100℃的水浴中。

注意事项: 加热已锁紧的试管会产生压力划伤或裂缝玻璃制品能够破裂。建议加热时利用化学安全盖或利用塑料盾。全程穿戴安全护目镜。

●五分钟之后，从沸腾的水中移开试管并轻微的冷却它不要打开盖子，震荡每支试管5-10

秒再放试管回水浴中。

●确认试管漏损,此刻是否有气泡在试管中升起为证据,再栓紧有漏的试管的盖子，如果继