OMEGArna提取试剂盒中文说明

E.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps)

步骤

A ． 真核细胞和组织

自己需要的材料：

β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC 水配置）、除RNase 的枪头和EP 管。 材料的最佳量

想得到最佳的产量和好的Hibind RNA 柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA 柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug 的RNA 。TRK 裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg 的组织。 细胞的步骤

1． 用500ul 的TRK 裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP 管或者用

枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。

a) 使用前每1ml TRK 裂解缓冲液加入20ul 的β－巯基乙醇。 b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器

里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK 裂解缓冲液至细胞中。加700ul 的TRK 到T35细颈瓶或10cm 的培养皿中，更小的培养器加500ul 的TRK 。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP 管中。

c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or 400*g ）*5min ，弃上清，加入TRK

裂解液，漩涡振荡混匀。

2． 匀浆化裂解产物

“裂解和匀浆化样品”－第四页有详细的说明，如果细胞≤1*105，漩涡振荡1min 。不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA 的产量还容易造成柱子堵塞。

a) 用匀浆器30 s ，使样品匀浆化。

b) 用钝的针头的注射器（0.9mm 直径），至少吹打5次是样品匀浆化。注射器要除

RNase 。

3． 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column 中，离心，≥1,4000*g, 3min,

室温。将离心收集的流出液转移到新的EP 管中。转到总RNA 分离中第4步。 组织的步骤：

1． 用500ul 的TRK 裂解缓冲液裂解细胞（≤30mg ），使用前每1ml TRK 裂解缓冲液加入

20ul 的β－巯基乙醇。

500ulTRK 裂解液最大裂解能力30mg ，难破碎的组织大于20mg 就用700ul 的TRK 裂解液。当组织量超出建议的最大量时，也不要超过40mg 。

组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用，除非是使用液氮， 2． 离心，≥1,5000*g, 5min, 室温。

3． 转移上清至，Homogenization Spin Column 中，离心，≥1,3000*g, 3min,室温。将离心收

集的流出液转移到新的EP 管中。 总RNA 分离：

4． 在裂解产物中加入50％体积（250ul －350ul ）的无水乙醇（96％－100％）混匀，漩涡振

荡20s 。

5． 样品转移到Hibind RNA Mini column 上，离心管的最大容量为750ul ，加完乙醇后可能

会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。室温离心，10,000*g,1min 。弃去流出液（透过柱子流出到离心管里的液体）。

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6． 将柱子放在一个新的2ml 收集管中，加上300ul RNA wash buffer I 。室温离心，10,000*g,

1min 。同样弃掉流出液。 7． DNase I 消化（选择性）

在我的实验中没有做这一步。

8． 将柱子再放到一个新的2ml 收集管中，加入400ul RNA wash buffer I, 室温离心，10,000*g,

30s ，弃流出液。

9． 将柱子放到2ml 收集管中，加入500ul RNA wash buffer II （乙醇稀释过的），室温离心，

10,000*g, 30s ，弃流出液。注意：使用前RNA wash buffer II 必须要用无水乙醇稀释，按照标签上的说明。 10． 用500ul RNA wash buffer II 洗涤一次柱子，同上一步骤一样。室温离心，10,000*g,

30s ，弃流出液。然后在空收集管中，以最大转速离心柱子，≥13,000*g, 2min, 室温，使的HiBind 基质完全干燥。 11． 转移柱子到一个新的1.5ml 的Ep 管中，（试剂盒中没有提供），加入50－100ul 的

DEPC 水洗脱柱子（试剂盒中提供）。确保水直接加到了柱子的基质上。13,000*, 1min, 室温。如果RNA 的总量大于50ug ，可以进行二次洗脱。

注意：可以选择性地，用大一点的体积洗脱RNA 。如果进行二次洗脱，总RNA 的量会增加，但是浓度会降低，因为80％以上的RNA 会在第一次时被回收。提前将水加热到70℃并室温孵育柱子5min 会增加产量。

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