第七章 发酵异常情况分析、处理与防治
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浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌对发酵的影响及处置
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌对发酵的影响
➢ 染菌对不同发酵过程的普遍性影响： ✓ 营养物质被杂菌消耗，菌体生长受到抑制，生物量和产物产量偏低； ✓ 产物被杂菌分解、严重时得不到产物：青霉素发酵； ➢ 不同染菌情况对不同发酵过程还有特殊的影响： ✓ 青霉素发酵：细短产气杆菌； ✓ 四环素发酵：双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌； ✓ 柠檬酸发酵：青霉菌； ✓ 谷氨酸发酵：噬菌体； ➢ 染菌时间和染菌程度的影响； ✓ 种子培养期； ✓ 发酵前期； ✓ 发酵中期； ✓ 发酵后期；
第七章 发酵异常情况的分析与防治
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
发酵的异常现象
➢ 什么是发酵异常情况：发酵液的物理参数、化学参数或 生物参数发生与正常情况不同的改变，并影响发酵水平， 使生产蒙受损失的情况；
➢ 发酵异常情况的类型：种子异常、发酵异常；
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的检查与判断
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的检查和判断
➢ 判断方法：无菌试验 ① 显微镜镜检法； ② 肉汤培养法； ③ 平板划线培养或斜面培养检查法； ④ 发酵过程的异常现象观察法：溶氧、尾气组成、pH值、耗糖、
（闻）气味、（看）颜色、；
➢ 如果发酵过程的产物代谢已达一定水平，此时产品的含量若达 一定值，只要明确是染菌也可放罐;
➢ 废弃前应加热至120℃以上、灭菌30min后才能排放;
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的处置策略：设备处理
➢ 放罐后进行彻底清洗，空罐加热至120℃以上、灭菌30min； ➢ 或甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12小时以上；
30
100 %
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌原因分析
term
10
原因不明
9
空气系统有菌
8
接种
7
外界带入杂菌
6
设备穿孔
5
管理问题
4
发酵异常
➢ 表现：菌体生长差、菌体生物量异常、菌体形态、pH值异常、 发酵液流动性黏度异常、泡沫过多、营养物质消耗异常等；
➢ 危害：无法达到期望的发酵目标； ➢ 可能原因： ①培养基组成：培养基原料、灭菌条件； ②培养条件：供氧（通气、搅拌）、pH值、温度； ③种子：种子质量（菌种老化、退化）、接种量； ④染菌：发酵过程中生产菌以外的菌株侵入发酵液并进行繁殖；
种子培养异常
➢ 表现：菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化和代谢异常； ➢ 危害：培养的种子不合格，影响后续发酵的正常进行； ➢ 可能原因： ①培养基组成：培养基原料、灭菌条件； ②培养条件：供氧（通气、搅拌）、pH值、温度； ③种子：种子质量（菌种老化、退化）、接种量； ④染菌：
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染菌的原因与防治
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌原因分析
term
14
原因不明
13
总空气系统有菌
பைடு நூலகம்12
操作问题
11
夹套穿孔
10
其他设备渗漏
9
种子带菌或怀疑种子带菌
8
盘管穿孔
7
搅拌轴密封渗漏
6
发酵罐盖漏
5
阀门渗漏
4
培养基灭菌不透
3
泡沫冒顶
2
接种管穿孔
1 接种时罐压跌零
0
5
10
15
20
25
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌判断：溶解氧异常
➢ 感染噬菌体后，生产
2
1
菌的呼吸作用受到抑 制，溶解氧浓度很快
上升；
3 ➢ 感染噬菌体后，溶解
氧的变化比菌体浓度
更灵敏，能更好地预 见染菌的发生。
谷氨酸的溶解氧变化曲线 1.正常发酵溶解氧曲线; 2. 异常发酵溶解氧曲线 3.异常发酵光密度值
浊，或平板培养连续三次发现有杂菌菌落的出现，即可判断为 染菌。 ➢ 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确 有可疑的染菌反应，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有 相同类型的杂菌存在，也应该判断为染菌； ➢ 无菌试验期间应每六小时观察一次无菌试验样品，以便能及早 发现染菌。
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的处置策略：发酵前期染菌
➢ 若培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基 加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；
➢ 若培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液， 补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，在接种进行发酵；
➢ 好气性发酵产生的CO2量与糖代谢有关，因此尾气中CO2含量 的变化看反映菌体的生长代谢情况；
➢ 杂菌污染如果使糖耗加快，则CO2含量增加；反之则降低； ➢ 噬菌体污染后，菌体生长受到抑制，糖耗减慢，CO2含量降低；
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染菌的检查和判断
➢ 以无菌试验和平板培养为主，其它方法为辅； ➢ 如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混
➢ 也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措 施进行处理；
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染菌的处置策略：发酵中、后期染菌
➢ 发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加 入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生 长速度;
➢ 也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等 其他措施，进行处理;
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染菌判断：溶解氧异常
➢ 感染好气性杂菌：溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至 接近于零，且在长时间内不能回升；
➢ 感染非好气性杂菌：生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧 量减少，溶解氧升高；
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染菌判断：尾气CO2含量异常
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染菌的处置策略：种子染菌
➢ 染菌种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并 对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌；
➢ 有备用种子：采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入 发酵罐，继续进行发酵生产；
➢ 无备用种子：则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为 种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从 而保证发酵生产的正常进行；
染菌对发酵的影响及处置
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染菌对发酵的影响
➢ 染菌对不同发酵过程的普遍性影响： ✓ 营养物质被杂菌消耗，菌体生长受到抑制，生物量和产物产量偏低； ✓ 产物被杂菌分解、严重时得不到产物：青霉素发酵； ➢ 不同染菌情况对不同发酵过程还有特殊的影响： ✓ 青霉素发酵：细短产气杆菌； ✓ 四环素发酵：双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌； ✓ 柠檬酸发酵：青霉菌； ✓ 谷氨酸发酵：噬菌体； ➢ 染菌时间和染菌程度的影响； ✓ 种子培养期； ✓ 发酵前期； ✓ 发酵中期； ✓ 发酵后期；
第七章 发酵异常情况的分析与防治
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发酵的异常现象
➢ 什么是发酵异常情况：发酵液的物理参数、化学参数或 生物参数发生与正常情况不同的改变，并影响发酵水平， 使生产蒙受损失的情况；
➢ 发酵异常情况的类型：种子异常、发酵异常；
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染菌的检查与判断
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染菌的检查和判断
➢ 判断方法：无菌试验 ① 显微镜镜检法； ② 肉汤培养法； ③ 平板划线培养或斜面培养检查法； ④ 发酵过程的异常现象观察法：溶氧、尾气组成、pH值、耗糖、
（闻）气味、（看）颜色、；
➢ 如果发酵过程的产物代谢已达一定水平，此时产品的含量若达 一定值，只要明确是染菌也可放罐;
➢ 废弃前应加热至120℃以上、灭菌30min后才能排放;
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染菌的处置策略：设备处理
➢ 放罐后进行彻底清洗，空罐加热至120℃以上、灭菌30min； ➢ 或甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12小时以上；
30
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染菌原因分析
term
10
原因不明
9
空气系统有菌
8
接种
7
外界带入杂菌
6
设备穿孔
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管理问题
4
发酵异常
➢ 表现：菌体生长差、菌体生物量异常、菌体形态、pH值异常、 发酵液流动性黏度异常、泡沫过多、营养物质消耗异常等；
➢ 危害：无法达到期望的发酵目标； ➢ 可能原因： ①培养基组成：培养基原料、灭菌条件； ②培养条件：供氧（通气、搅拌）、pH值、温度； ③种子：种子质量（菌种老化、退化）、接种量； ④染菌：发酵过程中生产菌以外的菌株侵入发酵液并进行繁殖；
种子培养异常
➢ 表现：菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化和代谢异常； ➢ 危害：培养的种子不合格，影响后续发酵的正常进行； ➢ 可能原因： ①培养基组成：培养基原料、灭菌条件； ②培养条件：供氧（通气、搅拌）、pH值、温度； ③种子：种子质量（菌种老化、退化）、接种量； ④染菌：
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染菌的原因与防治
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌原因分析
term
14
原因不明
13
总空气系统有菌
பைடு நூலகம்12
操作问题
11
夹套穿孔
10
其他设备渗漏
9
种子带菌或怀疑种子带菌
8
盘管穿孔
7
搅拌轴密封渗漏
6
发酵罐盖漏
5
阀门渗漏
4
培养基灭菌不透
3
泡沫冒顶
2
接种管穿孔
1 接种时罐压跌零
0
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染菌判断：溶解氧异常
➢ 感染噬菌体后，生产
2
1
菌的呼吸作用受到抑 制，溶解氧浓度很快
上升；
3 ➢ 感染噬菌体后，溶解
氧的变化比菌体浓度
更灵敏，能更好地预 见染菌的发生。
谷氨酸的溶解氧变化曲线 1.正常发酵溶解氧曲线; 2. 异常发酵溶解氧曲线 3.异常发酵光密度值
浊，或平板培养连续三次发现有杂菌菌落的出现，即可判断为 染菌。 ➢ 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确 有可疑的染菌反应，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有 相同类型的杂菌存在，也应该判断为染菌； ➢ 无菌试验期间应每六小时观察一次无菌试验样品，以便能及早 发现染菌。
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
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染菌的处置策略：发酵前期染菌
➢ 若培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基 加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；
➢ 若培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液， 补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，在接种进行发酵；
➢ 好气性发酵产生的CO2量与糖代谢有关，因此尾气中CO2含量 的变化看反映菌体的生长代谢情况；
➢ 杂菌污染如果使糖耗加快，则CO2含量增加；反之则降低； ➢ 噬菌体污染后，菌体生长受到抑制，糖耗减慢，CO2含量降低；
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的检查和判断
➢ 以无菌试验和平板培养为主，其它方法为辅； ➢ 如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混
➢ 也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措 施进行处理；
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的处置策略：发酵中、后期染菌
➢ 发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加 入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生 长速度;
➢ 也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等 其他措施，进行处理;
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染菌判断：溶解氧异常
➢ 感染好气性杂菌：溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至 接近于零，且在长时间内不能回升；
➢ 感染非好气性杂菌：生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧 量减少，溶解氧升高；
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌判断：尾气CO2含量异常
浙江大学宁波理工学院专业课程: 生物工艺学
染菌的处置策略：种子染菌
➢ 染菌种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并 对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌；
➢ 有备用种子：采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入 发酵罐，继续进行发酵生产；
➢ 无备用种子：则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为 种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从 而保证发酵生产的正常进行；