银染方法总结

银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。

大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。

由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。

这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究
银染操作规程
实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。

染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。

试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛
实验操作程序：
固定：30min或者更长时间
100ml 乙醇（40% 乙醇）25ml冰醋酸（10% 冰醋酸）加水到250ml
致敏：30min
75ml 乙醇（30% 乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min
银染：20min
0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)
显色：视情况而定
6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml
终止：10min
3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250ml
保存：1% 冰醋酸，4 ℃
注意事项：
1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。

2．甲醛在使用前加入。

3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。

4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。

5．银染液和显色液需要预冷。

6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！
7．清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。

银染注意事项:
1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。

2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。

乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。

如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。

3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。

因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。

4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.
5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。

6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS 的去离子水。

7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。

8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。

9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。

10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。

11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。

改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。

12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。

减少巯基乙醇的用量即可避免。

13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。

14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。

15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。

六我发个简单的配方，我一直用还挺好用，
固定甲醇250ml、冰醋酸25ml、加双蒸水至500ml ,30min,水洗2x2min，后水洗1h。

敏化硫代硫酸钠0.1g加双蒸水至500ml,冲洗双蒸水2x30s
银反应硝酸银0.5g加双蒸水至500ml，避光孵育30min，冲洗双蒸水2次x5min
显色碳酸钠10g加双蒸水至500ml，甲醛500ul，现用现加。

终止观察至想要效果，1%的冰醋酸终止，
七银染应该注意的事项:
1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。

2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。

乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。

如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。

3. 不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性蛋白染色效果差。

因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。

4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.
5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。

6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS 的去离子水。

7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。

8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。

不要用双蒸水
用去离子的，双蒸水的某些离子会和agno3反应
若用去离子水，也要经常给机器换滤头，以免去离子不净
一步骤溶液时间固定甲醇100ml 冰醋酸25ml 加双蒸水至250ml 30min
冲洗双蒸水3次
敏化甲醇75m 戊二醛（25%w/v）1.25ml 硫代硫酸钠(5%w/v) 10ml 醋酸钠（17g）30min 加双蒸水至250ml
冲洗双蒸水3次
银反应硝酸银溶液(2.5%w/v) 25ml 甲醛(37%w/v) 0.1ml 加双蒸水至250ml 20min
冲洗双蒸水2次
显色碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/v) 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min
终止EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min
冲洗双蒸水3次
二1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟
2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒
3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒
4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗
5）加中止液10％乙酸中止即可
三 1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；
2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；
3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；
4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；
5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；
6. 水洗：同上；
7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；
8. 水洗：同上；
9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

四 1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％（甲醇500ml 冰醋酸120ml）
2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）
甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml
3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02% （无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml）
4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）
染色步骤：
1 银染液1 洗2次，每次5分钟
2 银染液2 洗1次，每次30分钟
3 超纯水洗2次，每次1分钟
4 0.5%硝酸银洗30分钟
5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色
6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止
我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。

但水洗不充分又可能导致背景较深。

我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。

固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水
浸泡液：30%乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛0.625ml，0.2% NaS2O3•5H2O
银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛
显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛
终止液：1.46% EDTA-2Na•2H2O。