植物五种酶活性检测方法

植物五种酶活性检测方

法

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选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点

(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定

PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。

1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定

适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。

取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL,混合反应液（L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。

酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加为一个活性单位。

2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定

称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L（）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心

20min，取上清液即为酶提取液。

取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化为一个活力单位。

3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定

取新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。

Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化作为一个活力单位。

4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）

取克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质L 的磷酸缓冲液（含

1%PVP[聚乙烯吡咯烷酮）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h。1000r/min离心20min,得到酶初提液。

取200mlPBS[磷酸缓冲液]（，），加入液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入 30%的H202,混匀后保存于冰箱中备用。取3ml反应液并加入30ul酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定30s读数一次，5分钟）。（边加样边测定，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始计时的时间相差不大）酶活性计算：以每分钟OD值得变化（升高）为一个酶活性单位（u）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs××t）(u/gmin)

ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

5、过氧化氢酶（Catalase CAT）活性测定

取克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质L 的磷酸缓冲液（含1%PVP）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h。1000r/min离心20min,得到酶初提液。

取200ml PBS（，），加入 30%的H2O2（原液）摇匀即可。

取3ml反应液加入（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。（测定30s读数一次，5分钟）。

酶活性计算：以每min OD值减少为1个酶活性单位（u）。

CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs××t） (u/g min)

ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, ）。