巴尔通体菌株的保存与复苏

　文章编号:100023711(2007)022*******

巴尔通体菌株的保存与复苏3

杨　慧,白鹤鸣,杨发莲

(云南省地方病防治所,云南大理671000)

摘要:目的　探索巴尔通体菌株保存和复苏的方法及其条件。方法　应用传代持续培养保存法和冷冻保藏法对所保存菌株进行实验,并对冷冻保藏后的菌种进行复苏试验。结果　两种方法能较好地保存巴尔通体菌株,复苏后生长良好。

结论　两种方法保存菌种是可行的。巴尔通体菌株对冷冻和反复冻融有很强的抵抗力。

关键词:巴尔通体;保存;复苏

中图分类号:R513.6;R376.6文献标识码:A

Preserva ti on and Recovery of B a rtonella Stra i n s

Y ANG Hui,BA I He-m ing,Y ANG Fa-lian

(Yunnan Institute of Ende m ic D iseases Control and

P revention,D ali,Yunnan671000,China)

Abstract:O bjecti ve　To study the methods and conditi on on p reservati on and recovery of B artonella spp.M ethods　The strains were selected t o test for B artonella p reservati on with rep r oductive culture and freezing methods.Results　Strains could be p reserved with t w o methods and strains gre w well after recovering fr om-70℃and-196℃.Conclusi on s　T wo methods are effective f or strains p reservati on.B a rtonella spp.

is highly resistant t o freezing and freeze-tha w cycles.

Key words:B artonella;Preservati on;Recovery

巴尔通体属(B artonella)是一群革兰氏染色阴性、营养条件要求苛刻、兼性细胞内寄生的需氧杆菌或球杆菌,它在体外培养时生长缓慢,并具有多形性的特点。巴尔通体菌(B artonlla s pecies)分类学上属于变形菌(P roteobacteria),α-变形菌纲(A l phap r oteobacte2 ria),根瘤菌目(Rhiz obiales),巴尔通体科(Bart onel2 laceae),近年来该属细菌不断地有更多的新种被分离和确定,目前已经命名的巴尔通体一共有20个种,其中B.vinson ii有3个亚种,其中有9种和人类疾病有关。由于其种群比较复杂,如何采用适当的保存方法,保证菌种的延续,将为巴尔通体病的各项基础研究提供菌种是十分必要的。本文对该菌种保存和复苏的方法及条件进行探讨。

1　材料和方法

1.1　材料:从云南省滇西地区鼠类中分离培养到的并经PCR扩增测序证实的巴尔通体菌株。培养基为5%兔血心浸液琼脂培养基。

1.2　巴尔通体菌株的保藏方法:

1.2.1　传代持续培养保存法:实验所用培养基是含5%兔血心浸液琼脂培养基(Bect on D icks on and Co m2 pany Cockeysville,MD)。传代时用铂金环挑取纯菌于含5%两性霉素B的脑心浸液中,混匀后接种于新鲜培养基中,置含5%二氧化碳培养箱中35℃下培养,待菌落生长出来以后用封口膜密封平皿,移至4℃的冰箱中保存,1～3个月转种一次,如此反复进行即可。1.2.2　冷冻保藏法:我们分别实验了低温冰箱保存法(-10℃,-20℃,-40℃,-70℃)和液氮(-196℃)保存法,此实验是用铂金环收集平皿上生长良好的菌落,放入2mL含50%甘油的营养液冻存管中,分别储存于-10℃,-20℃,-40℃,-70℃的低温冰箱和-196℃的液氮保藏器中。

1.2.3　复苏试验:复苏菌种时,将冻存管取出,置于4℃冰箱中缓慢解冻,再拆开冻存管,将内容物分别接

3收稿日期:2006-10-27

基金项目:国家自然科学基金资助(30360093)作者简介:杨慧(1969-),女,主管技师1

种于含5%兔血心浸液琼脂培养基中,放入含5%二氧化碳培养箱中孵育,每隔24h观察平皿一次。

2　结果

传代培养保存法所保存的菌株,从培养箱中移出接种后3～4d可观察到菌落生长。4种不同温度条件下的冷冻保存复苏试验,分别在接种后第3～7d观察到菌落,其中-70℃,-196℃保存条件的菌种复苏,较其他条件(-10℃,-20℃,-40℃)保存的生长得更好。

3　讨论

从临床样本中分离巴尔通体需要特殊的培养基,并且延长培养时间。培养基pH在7.0～7.5之间的,含有多种营养成分(胰蛋白酶、脑心浸液)的血或者巧克力琼脂。培养温度为35℃,并要求有很高的湿度。除B.bacillifor m is外,其他巴尔通体的培养还需要培养箱内有5%的CO

2

。巴尔通体菌落很小,直径在1～3 mm之间,圆形的白色或者灰白色,菌落有半透明的和不透明的。菌落生长一段时间后,从干燥变为粘稠。刚分离培养的菌落附着在培养基上并呈凹陷状,这种性状经过几代体外培养后消失。初次分离培养巴尔通体,要经过3～5w时间才能看到菌落生长。然而次代接种,只需要2～5d就能看到菌落。这种菌落的变异是由细菌表面抗原结构的变异引起的。

此次实验结果证明两种保存方法对巴尔通体菌种的保存是行之有效的。传代培养保存法的优点是操作简单,使用方便,不需要特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等;缺点是遗传性容易发生变异,因为培养基的物理化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使菌种的代谢改变,病原性和生理活性物质的产生能力等可能降低,而影响菌种的性状;需要定期移种,费时费力,费成本且占用的地方较多;往往由于培养基成分质量的变化,接种的菌种不能繁殖甚至丢失,杂菌污染的机会亦很多。而使用液氮深冻保藏法能长期保存菌种,而且性状不变异,毒力也不减弱,缺点是需要特殊设备。此次实验发现巴尔通体菌对冷冻和冻融有很好的耐受力,菌株在加有甘油保护剂和-70℃下能长期储存。巴尔通体属可引起人类多种疾病,且新的菌种在不断地发展,故采用最适的保存方法,将对巴尔通体属及其种和亚种的深入研究提供优良的菌种,对这一古今交融的致病菌所引起的各种感染,将有更全面的认识。(本文编辑:毕永江)

(上接第8页)

1.3　调查方法:(1)首先按各个监测点的时间和每例被调查者的姓名与试管编号,上午到单位采静脉血2mL,注入编好号的试管内,并认真核对姓名、年龄、性别和编号,下午进行检测。

(2)酶联免疫吸附试验(E L I S A)法,此法具有快速简便、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。检测过程中如怀疑感染乙型肝炎或假阳性者,应立即重做。试剂采用上海实业科华生物技术有限公司的立可读。目测法判定结果。

2　结果

在检测的1386人中,检出HB s Ag阳性者133人,阳性率为9.60%;检出抗-AB s阳性者392人,阳性率为28.28%;检出HBe Ag阳性者49人,阳性率3.53%;检出抗-HBe阳性者38人,阳性率2.74%;检出抗-HBc阳性者91人,阳性率为6.56%。

2.1　地区分布:由检测结果可知,检测居住在团部及附近的学生共997人,HB s Ag阳性者85人,阳性率为8.53%;而连队被检测的389人中,HB s Ag阳性者48人,阳性率为12.34%。

2.2　性别分布:1386人中,男性738人,检出HB s Ag阳性者76人,阳性率10.30%;抗-HB s阳性者206人,阳性率为27.90%;抗-HBc阳性者57人,阳性率8.70%。女性648人中检出HB2 s Ag阳性者57人,阳性率8.70%;抗-HB s阳性者186人,阳性率28.70%;抗-HBc阳性者40人,阳性率6.20%。男性的HB2 s Ag阳性率明显高于女性;抗-HB s阳性率,男性低于女性;抗-HBc阳性率男性高于女性。

3.3　年龄分布:由统计分析结果可以看出,检测2～20岁977人,HB s Ag阳性者84人,阳性率8.60%;抗-HB s阳性者287人,阳性率29.38%;21～54岁共检测409人,检出HB s Ag阳性者49人,阳性率11.98%;抗-HB s阳性者105人,阳性率25.67%。检测结果表明,学生的HB s Ag阳性率低于成年人,抗-HB s阳性率学生高于成人。

3　讨论

(1)本次调查结果接近国家估算的10%的结果。21～54岁人群的HB s Ag明显高于国家估算的11.98%水平,病毒携带有上升趋势。本次调查显示患HB s Ag的人群有明显的聚集性和家族性,由此说明了3种原因:①在日常生活中,与HBV感染者之间的密切接触,造成家族性发病;②常与HBV感染者频繁共用餐具;③常使用未经消毒或消毒不严的餐具。在学生中查出“大三阳”的都及时隔离或休学治疗,避免传播,同时对HBV 感染阴性者建议进行乙肝疫苗预防接种,使机体产生对HBV 的自动免疫。

(2)通过本次调查可以看出,全团多数的职工及家属,缺乏对乙肝病毒的正确认识和深入了解,缺乏自我保护意识。从本次调查可知,大部分人没有接种过乙肝疫苗,需要疾病预防控制中心的工作人员高度重视传染病防治工作,加强健康教育,加强乙肝疫苗的接种工作,降低乙型肝炎的发病率。

(本文编辑:李成文)