毛细管电泳
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
白和α、β、γ球蛋白；1948年，获诺贝尔化学奖。
二、经典电泳分析
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分 析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。
按形状分类： U型管电泳、柱状电泳、板电泳
按载体分类： 滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳
缺点：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其 他分析相比。
•正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 •负溶质离子所受的力：电场力 电渗力 •中性分子所受的力：电渗力
➢ 电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，混合物 中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。
➢ 流出顺序：①正离子②中性粒子③负离子
电 泳 过 程 中 不 但 可 以 按 类 分 离 , 除 中 性
有关物质 有关物质 有关物质 有关物质
例：毛细管电泳（抑肽酶）
AU
0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 -0.006
15
18.417分钟的是去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶， 18.617分钟的是去丙氨酸-抑肽酶， 18.829分钟的是抑肽酶峰
18.829
5、进样方式
进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小
1. 流体力学进样方式 进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样
2. 电动进样方式 毛细管一端插入样品瓶，加电压
3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。
七、 应用 1、离子分析
2、药物分析
采用MEKC模式， 鉴定违禁药物； 效果优于HPLG法
3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）
（1）缓冲液中加入表面活性剂，其浓度达到临界浓度， 形成一疏水内核、外部带负电的胶束(假固定相)。
（2）电泳流和电渗流的方 向相反，且ν电渗流>ν电泳 ，电 场力的作用下负电胶束以较 慢的速度向负极移动；
3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）
3.缓冲液池
要求 ➢化学惰性 ➢机械稳定性好
——玻璃瓶
4. 检测器
➢要求：具有极高灵敏度，可柱上或柱端检测
类型 紫外-可见 荧光 激光诱导荧光 电导
检测限/mol 10-13～10-15 10-15～10-17 10-18～10-20 10-18～10-19
特点 加二极管阵列，光谱信息 灵敏度高，样品需衍生 灵敏度极高，样品需衍生 离子灵敏，需专用的装置
毛细管电泳法 Capillary Electrophoresis
一、电泳的含义
电泳：在电场作用下，电解质溶液中的带电质点在
电场力作用下向电荷相反的电极方向迁移的过程。
由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速 率不同，可实现分离。
1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典) 第一次用 自由溶液电泳从人血清提取的蛋白混合液分离出白蛋
粒子外,同种类离子由于受到的电场力大 小不一样也同时被相互分离。
五、主要分离模式
毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE） 胶束电动毛细管色谱（MECC） 毛细管离子分析
1、毛细管区带百度文库泳 CZE
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 •正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 •负溶质离子所受的力：电场力 电渗力 •中性分子所受的力：电渗力 ➢流出顺序：①正离子②中性粒子③负离子
（3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏 水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
（4）可用来分离中性物质。 （5）色谱与电泳分离模式的结合。
4、 毛细管电色谱 CEC
在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定 液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配 为分离机理的电动色谱过程
固定相：依HPLC理论和经验选择，反相应用多 缓冲液：水溶液或有机溶液。
最基本、应用广的分离模式
2、毛细管凝胶电泳 CGE
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶,类
似分子筛的作用
——试样分子按大小分离。
蛋白质、DNA等的 m/z与分子大小无关，CZE模式很难 分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段
无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代
替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。
三、高效毛细管电泳分析
技术上的重要改进：
➢ 采用了0.05mm内径的毛细管 ➢ 采用了高达数千伏的电压
特点：
A、分离效率高：104理论塔板数，接近GC 空心管，无固定液，H = B/u；流型不同
B、 分离速度快：优于LC，接近GC C、进样量少：nL
四、分离过程
电泳：带电粒子在电场作用下迁移 电渗：溶剂在电场作用下的单向流动
常用甲醇-水、乙睛-水等
六、 高效毛细管电泳仪器
1.高压电源
（1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源 （2）电场强度程序控制系统 （3）电源极性易转换
2. 毛细管柱
➢要求：电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性 ➢材料：石英（各项性能好）、玻璃 ➢规格：内径20~75 um，外径350~400um；长度<=1m
3、氨基酸分析
4、蛋白质分析
5、核酸分析及DNA排序
➢2010版药典二部采用电泳法的品种
乌司他丁
还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量
乌司他丁溶液 还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量
肝素钠乳膏 鉴别（琼脂糖电泳）
➢2010版药典二部采用CE的品种
盐酸头孢吡肟 注射用盐酸头孢吡肟 抑肽酶 注射用抑肽酶
18.417 18.617
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Minutes
sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图
二、经典电泳分析
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分 析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。
按形状分类： U型管电泳、柱状电泳、板电泳
按载体分类： 滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳
缺点：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其 他分析相比。
•正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 •负溶质离子所受的力：电场力 电渗力 •中性分子所受的力：电渗力
➢ 电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，混合物 中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。
➢ 流出顺序：①正离子②中性粒子③负离子
电 泳 过 程 中 不 但 可 以 按 类 分 离 , 除 中 性
有关物质 有关物质 有关物质 有关物质
例：毛细管电泳（抑肽酶）
AU
0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 -0.006
15
18.417分钟的是去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶， 18.617分钟的是去丙氨酸-抑肽酶， 18.829分钟的是抑肽酶峰
18.829
5、进样方式
进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小
1. 流体力学进样方式 进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样
2. 电动进样方式 毛细管一端插入样品瓶，加电压
3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。
七、 应用 1、离子分析
2、药物分析
采用MEKC模式， 鉴定违禁药物； 效果优于HPLG法
3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）
（1）缓冲液中加入表面活性剂，其浓度达到临界浓度， 形成一疏水内核、外部带负电的胶束(假固定相)。
（2）电泳流和电渗流的方 向相反，且ν电渗流>ν电泳 ，电 场力的作用下负电胶束以较 慢的速度向负极移动；
3、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）
3.缓冲液池
要求 ➢化学惰性 ➢机械稳定性好
——玻璃瓶
4. 检测器
➢要求：具有极高灵敏度，可柱上或柱端检测
类型 紫外-可见 荧光 激光诱导荧光 电导
检测限/mol 10-13～10-15 10-15～10-17 10-18～10-20 10-18～10-19
特点 加二极管阵列，光谱信息 灵敏度高，样品需衍生 灵敏度极高，样品需衍生 离子灵敏，需专用的装置
毛细管电泳法 Capillary Electrophoresis
一、电泳的含义
电泳：在电场作用下，电解质溶液中的带电质点在
电场力作用下向电荷相反的电极方向迁移的过程。
由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速 率不同，可实现分离。
1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典) 第一次用 自由溶液电泳从人血清提取的蛋白混合液分离出白蛋
粒子外,同种类离子由于受到的电场力大 小不一样也同时被相互分离。
五、主要分离模式
毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE） 胶束电动毛细管色谱（MECC） 毛细管离子分析
1、毛细管区带百度文库泳 CZE
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 •正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 •负溶质离子所受的力：电场力 电渗力 •中性分子所受的力：电渗力 ➢流出顺序：①正离子②中性粒子③负离子
（3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏 水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
（4）可用来分离中性物质。 （5）色谱与电泳分离模式的结合。
4、 毛细管电色谱 CEC
在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定 液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配 为分离机理的电动色谱过程
固定相：依HPLC理论和经验选择，反相应用多 缓冲液：水溶液或有机溶液。
最基本、应用广的分离模式
2、毛细管凝胶电泳 CGE
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶,类
似分子筛的作用
——试样分子按大小分离。
蛋白质、DNA等的 m/z与分子大小无关，CZE模式很难 分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段
无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代
替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。
三、高效毛细管电泳分析
技术上的重要改进：
➢ 采用了0.05mm内径的毛细管 ➢ 采用了高达数千伏的电压
特点：
A、分离效率高：104理论塔板数，接近GC 空心管，无固定液，H = B/u；流型不同
B、 分离速度快：优于LC，接近GC C、进样量少：nL
四、分离过程
电泳：带电粒子在电场作用下迁移 电渗：溶剂在电场作用下的单向流动
常用甲醇-水、乙睛-水等
六、 高效毛细管电泳仪器
1.高压电源
（1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源 （2）电场强度程序控制系统 （3）电源极性易转换
2. 毛细管柱
➢要求：电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性 ➢材料：石英（各项性能好）、玻璃 ➢规格：内径20~75 um，外径350~400um；长度<=1m
3、氨基酸分析
4、蛋白质分析
5、核酸分析及DNA排序
➢2010版药典二部采用电泳法的品种
乌司他丁
还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量
乌司他丁溶液 还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量
肝素钠乳膏 鉴别（琼脂糖电泳）
➢2010版药典二部采用CE的品种
盐酸头孢吡肟 注射用盐酸头孢吡肟 抑肽酶 注射用抑肽酶
18.417 18.617
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Minutes
sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图