毛细管电泳

柱效和分离度
类似于HPLC，CEC的柱效可用vanDeemter方程表征：
作为一种重要的分离分析手段，CE和CEC仍沿用分离度R 作为衡量分离程度的指标，并定义如下：
R
2(t R2 t R1 ) (W2 W1 )
毛细管电泳和电色谱仪器装置
仪器基本结构
1 高压电源；2 毛细管；3 检测器；4 电极；5 缓冲液瓶；6 恒温系统；7 记录仪
图21-6 电渗流反向示意图
毛细管区带电泳（CZE）
应用 毛细管区带电泳特别适合分离带电化合物，包括无机阴离子、 无机阳离子、有机酸、胺类化合物、氨基酸、蛋白质等，不能 分离中性化合物。
毛细管区带电泳3分钟内分离30种阴离子电泳图
胶束电动毛细管色谱（MEKC）
MEKC是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表 面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏 水基团聚集在一起形成胶束，成为分离体系的准固定相，溶质 基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。
度量电渗流大小是单位电场下的电渗流速率即电渗淌度 (eo)或电渗速率(ueo)，可用Smoluchowski 方程表示：
o w eo
o w E u eo eo E
u eo Ld 1 Ld Lt eo E t0 E to U
进样系统
毛细管分离通道十分细小，整个柱体积一般只有 4~5μL， 所需的样品区带只有几纳升。 毛细管电泳的进样方式一般是将毛细管的一端从缓冲液移 出，放入试样瓶中，使毛细管直接与样品接触，然后由重力、 电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控 制驱动力的大小或时间长短来控制。 CE 进样技术均适用于 CEC。 目前有三种方法可以让样品直接进入毛细管：
u uep ueo (e p eo )E
令µ app=µ ep + µ eo，称之为表观淌度，即从毛细管电泳测量 中得到的淌度为粒子自身的电泳淌度和由电渗引起的淌度之 和，并有 Ld Lt app e p eo u / E tr U 在典型的毛细管电泳分离中，溶质的分离基于溶质间电泳 速率的差异。电渗流的速率绝对值一般大于粒子的电泳速率， 并有效地成为毛细管电泳的驱动力。溶质从毛细管的正极端 进样，带正电的粒子最先流出，中性粒子次之，带负电的粒 子在中性粒子之后流出。溶质依次通过检测器，得到与色谱 图极为相似的电泳分离图谱。
1.高压电源
（1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出；
（3）电场强度程序控制系统；
（4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换；
2. 毛细管柱
（1）材料：石英：各项 性能好；玻璃：光学、机 械性能差； （2）规格：内径20～ 75μ m，外径350～400μ m； 长度<=1m
化学惰性，耐有机溶剂和宽pH值的缓冲液； 有合适的孔隙率，既不使流动相受阻，又可防止固定相 颗粒通过； 死体积小，避免电色谱峰展宽。
柱塞制作方法很多，目前应用较多的有水玻璃烧制法和 填料直接烧制法。
第17章 毛细管电泳
electrophoresis

20世纪30－40年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius） 建立了移动界面电泳，将电泳 发展成分离技术 获得1948年诺贝尔化学奖
1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为 毛细管电泳的发展奠定了基础。
毛细管电色谱柱技术
毛细管电色谱（CEC）是毛细管电泳与高效液相色谱的 有机结合，其基本理论、仪器装置与毛细管电泳大致类似。
最大的不同是毛细管柱引入了色谱固定相，使CEC同时 具有CE与HPLC的分离机理，对中性物质和荷电物质都能达到 理想的分离效果。
因此毛细管柱是CEC的心脏，制柱技术是CEC的关键。按 照固定相不同形式，CEC可分为填充柱、开管柱和整体柱 （连续床）。
e vep E 6
电泳淌度（μep)定义为单位场强下离子的平均电泳速率， 即
ep
vep E
Байду номын сангаас
电渗
电渗是毛细管中整体溶剂或介质在轴向直流电场作用下发 生的定向迁移或流动。 电渗的产生和双电层有关，当在毛细管两端施加高压电场 时，双电层中溶剂化的阳离子向阴极运动，通过碰撞作用带 动溶剂分子一起向阴极移动，形成电渗流(EOF)。
毛细管等速电泳（CITP）
1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满 毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间， 并以同一速度移动。 2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负 离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐 渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。 3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同 (ν =μ E)，淌度大的离子区带电场强度小； 沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该 区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中 离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队； 4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；
填充柱
填充柱在CEC中应用最广泛，其最大优点是可以利用众 多的HPLC固定相，根据化合物与固定相作用不同实现高效分 离。
1 入口柱塞; 2 填充部分; 3 出口柱塞; 4 检测窗口; 5 开管部分
填充柱
柱塞制作 柱塞的制作对于填充柱非常关键。合格的柱塞必须满足 如下要求：
有足够的机械强度,能够承受填充时的高压；
毛细管等电聚焦（CIFF）
1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围 的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时， 管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在 酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中 性，淌度为零； 4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移， 分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形 成窄溶质带而相互分离。
毛细管区带电泳（CZE）
在CZE分离中，除了背景电解质外，常常还在缓冲溶液中 加入某些添加剂： 1.中性盐
2. 表面活性剂
3. 手性添加剂 对于许多水难溶的样品，如 果在缓冲液中加入少量的有机溶 剂，常常能有效改善分离度。在 极端情况下，可完全使用有机溶 剂，或以有机溶剂为主体，这就 是非水毛细管电泳技术。
电动法、压力法和浓差扩散法。
电源及其回路
电流回路系统包括高压电源、电极、电极槽、导线和电 解质缓冲溶液等。CE和CEC一般采用0 ~ ±30 kV连续可 调的直流高压电源。理想的电源应具备： 1.能输出单极直流高压(一端接地)； 2.电压、电流、功率输出模式任意可选； 3.能控制电压、电流或电功率的梯度； 4.电压输出精度应高于1%。 CE的电极通常由直径0.5~l mm的铂丝制成。 电极槽，即缓冲液瓶，通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料 瓶(1~5mL不等)，要便于密封。缓冲液内含电解质，充于 电极槽和毛细管中，通过电极、导线与电源连通，一同 构成整个电流回路。
4. 缓冲液溶剂
5. 离子强度 6. 添加剂 7. 管壁涂层
毛细管电泳
2 电泳和电渗
– 电渗流的流型特点
电渗流 塞流
HPLC 层流
Zeta电势-ζ 固液两相间的 总电势-热力学 电势-φ0
分离原理
电泳和电渗流并存，在不考虑相互作用的前提下，粒子在 毛细管内电介质中的迁移速率是两种速率的矢量和：
毛细管凝胶电泳（CGE）
毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis;CGE)是在毛细 管中充填多孔凝胶作为支持介质进行电泳，其分离是基于筛分 机理。
CGE常用于蛋白质，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分离 和测定。
凝胶是毛细管电泳的理想介质，粘度大，抗对流，能减少 溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽，所得的峰型尖锐，柱效 高，有可能使组分在短柱上实现极好的分离。 常用的凝胶有聚丙烯酰胺和琼脂糖，应用最多的是前者。
分离原理
毛细管电色谱由于引入了色谱机制，其保留机理包括两个 方面: 其一，如同HPLC，基于溶质在固定相和流动间分配过程； 其二，如同 CE ，基于溶质电迁移过程。 CEC 容量因子可 用下式表示：
k k 'k ' (ep / eo ) ep / eo
由于 CEC 既能分离电中性溶质，又能分离带电溶质，对 复杂的混合样品显示出强大的分离潜力。
u eo
Ld t0
电渗
以电场力驱动产生的溶液EOF，与高效液相色谱中由高压 泵产生的液体流型不同：
电渗是CE的基本现象之一，它可以控制组分的迁移速率和 方向，进而影响CE的分离效率和重现性，所以电渗流控制 是CE中的关键问题或技术之一。
电渗流的控制
影响电渗流的因素很多，直接影响因素有： 1. 电场强度 2. 温度 3. pH值
毛细管电泳
毛细管电泳的原理
1 装置
毛细管 电极 试样 检测器 电极 数据处理
缓冲液
高压电源
（可高至30KV）
缓冲液
电泳
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度 或速率向其所带电荷相反电场方向迁移的现象叫作电泳。阴 离子向正极方向迁移，阳离子向负极方向迁移，中性化合物 不带电荷，不发生电泳运动。 在充满自由溶液开口管中球形粒子的电泳速率公式为：
柱效和分离度
与色谱相同，CE和CEC的柱效一般也用塔板数N或塔板高 度H来表示。实际应用中，可根据以下公式计算：
tR N 5.54 2 t 1/ 2
2
从理论上分析，CE分离的柱效可表示为
D为扩散系数，样品相对分子质量越大，扩散系数越小， 柱效越高，所以毛细管电泳比色谱更适合于生物大分子分离 分析。
毛细管结构
毛细管是CE分离的心 脏。理想的毛细管必须是电 绝缘、紫外/可见光透明且富 有弹性的，目前可以使用的 有玻璃、熔融石英或聚四氟 乙烯塑料等。毛细管内径一 般为10 ～100μm，其截面 结构图标意图如图17.23所示。
紫外吸收
检测系统
检测系统
毛细管电泳分离类型及应用
毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis; CZE） 基本操作条件 毛细管区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细 管电泳最基本、也是应用最广的一种操作模式。其分离原理是 基于样品组分荷质比的差异。 需要控制的操作变量主要是电压、缓冲液浓度、pH值和添 加剂等。 缓冲液的选择通常须遵循下述要求： 1．在所选择的pH范围内有合适的缓冲容量。 2．本底检测响应低。 3．自身的淌度低，即离子大而荷电小。
上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分 析方法。
毛细管电泳（capillary electrophoresis;CE）是一类以 高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中 各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相 分离分析技术。 毛细管电泳是分析科学中继高效液相色谱之后的又一 重大进展，它使分析科学从微升水平得以进入纳升水平， 并使单细胞分析成为可能。 毛细管电色谱（capillary electrochromatography; CEC）是毛细管电泳与液相色谱相结合形成的一种高效、 快速微分离分析技术。
毛细管及其温度控制
熔融石英毛细管在CE中应用最广泛，熔融石英拉制得 到的毛细管很脆，易折断，一般在外表面涂有聚酰亚胺 保护层，使之变得富有弹性，不易折断。
内径越小，表面积/体积比越大，散热效果越好。内径 小，样品负载小，检测、进样、清洗等操作困难。 一般使用的毛细管柱内径在25 ~100 μm之间，目前最常 用的是50μm和75μm两种。 检测窗口部位的外涂层剥离。 焦耳热效应产生径向温度梯度，还会导致分离重现性差。 商品仪器大多有温度控制系统，主要采用风冷和液冷两 种方式。 一般采用物理吸附或化学键合两种方式形成毛细管内壁 涂层，对石英毛细管进行改性或修饰，可有效控制电渗 流、抑制吸附进而优化分离。