医学遗传学试验讲义

医学遗传学实验讲义浙江大学医学院医学遗传学课程组2012年9月3日实验一人类外周血染色体标本制备一、实验目的通过实验了解和掌握人类外周血染色体标本培养和制备的基本方法。

二、实验原理正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。

1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）或其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。

这样经过短期培养（colchicine），秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。

本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

三、实验准备实验材料人外周血（淋巴细胞）实验器具离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头（6 1/2号）、吸管、量筒、火柴、酒精灯、pH计、研钵、饭盒、超净工作台、镊子、载玻片、玻片盒、烧杯、染缸、试管架、玻璃铅笔或记号笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。

药品和试剂1．培养液的配制RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80%小牛血清(56℃水浴灭活30分钟，灭活可破坏补体及一些污染的病毒) 20%植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质,可用培养基溶解) 4%青霉素终浓度100U/ml链霉素终浓度100U/ml用3.5%NaHCO3调pH7.0～7.2，用玻璃滤器，抽滤灭菌。

在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5 ml）。

培养液置于-20℃冰箱保存。

使用前从冰箱中取出，温育至37℃。

2．肝素浓度为0.2%，作为抗凝剂使用。

200 mg肝素粉末溶于100 ml生理盐水中。

高压灭菌，-4℃冰箱保存备用。

3．KCl浓度为0.075 M，0.559 g氯化钾溶于100 ml双蒸水中。

氯化钾作为低渗液的优点是染色体轮廓清楚，可染性增强，时间缩短。

4．秋水仙素10 μg/ml，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。

称取10 mg秋水仙素溶于100 ml生理盐水中，配成100 μg/ml的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存备用。

临用时取上述原液用生理盐水稀释成10 μg/ml。

5．甲醇6．冰醋酸7．吉姆沙(Giemsa)染液吉姆沙原液：先将0.5g吉姆沙粉末干研磨，时间越长越好；加33 ml 60℃预热的纯甘油，在研钵中研磨，放在60℃恒温水浴中保温90分钟。

冷却后，再加入33 ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存，作为原液。

原液要提前半年配制。

原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。

1份Giemsa原液＋9份磷酸缓冲液8．磷酸缓冲液(pH 6.8)溶液A：磷酸二氢钾(KH2PO4.2H2O) 9.078 g溶于1000ml蒸馏水中。

溶液B：磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O) 11.876 g溶于1000ml蒸馏水中。

100ml缓冲液：需溶液A50.8 ml，溶液B 49.2 ml。

四、实验步骤1．采血先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取2 ml干燥灭菌注射器，配上针头（6 1/2号）并吸取肝素液0.2 ml湿润针筒，采静脉血2 ml，转动针筒使血与肝素混匀。

2．培养采血完毕立即将针头插入含RPMI 1640培养瓶内（瓶盖预先用酒精棉球消毒），每瓶滴入30滴血，摇匀。

2 ml血可分装三至四瓶。

置37℃ 0.5℃恒温中培养72小时，其间可摇动2~3次。

3．秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前2~3小时，加入秋水仙素，6 1/2号针头3滴（每ml约60滴），使细胞分裂终止在中期。

秋水仙素的浓度不宜过高和作用时间过长，虽然这样做可以得到较多的分裂相，但导致染色体过分缩短，不宜用于显带分析。

4．离心将培养物倒入刻度离心管内，以1000rpm离心10分钟，弃去上清液，留底层沉淀物并用吸管打匀。

5．低渗处理加8 ml预温(37℃)的0.075 M KCl低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25~30分钟，使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。

低渗处理的效果与低渗的成分、处理的时间和温度有关。

这是比较关键的一步，对任一组织和低渗液都要事先进行预实验，以确定最合适的处理时间。

6．预固定在低渗25~30分钟后，加新配置的固定剂（甲醇:冰醋酸，3:1 ）1ml，打匀。

这样有助于细胞的均匀悬浮而不团聚凝块和防止细胞丢失。

甲醇和冰醋酸要现配现用，如放置时间较长，即不宜再用，以免影响固定效果。

7．再离心1000 rpm离心10分钟，弃去上清液，留沉淀物。

8．固定沿离心管壁加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）至5ml，将沉淀物打匀，固定15~25 分钟。

9．再离心1000 rpm离心10分钟，弃去上清液。

10．再固定：加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1:3）至5 ml打匀，固定15~25分钟。

11．再离心1000 rpm离心10分钟，弃去上清液。

12．再固定加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1:1）至5 ml打匀，固定15~25分钟，或冰箱中放置数小时，也可以过夜。

13．制片经上述固定后，1000 rpm离心留下约0.3 ml沉淀物，打匀。

用吸管吸取细胞悬液，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在酒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（或用电吹风吹干）。

14．染色用Giemsa染液染色8分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。

15．镜检将染色后的玻片先用低倍镜全面检查，找到良好的分裂相，换用高倍镜、油镜观察分析。

五、注意事项1．在采血接种培养时，注意不要加入太多的肝素。

肝素过多时可能引起溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂；但肝素也不能过少，以免发生凝血现象。

2．培养基中不含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，则溶解有RPMI 1640培养基的液体可先用浓盐酸调pH4.0，然后高压灭菌（注意121℃，0.15 MPa，灭菌15分钟）。

冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA、灭活小牛血清和双抗，再调pH7.0，分装备用。

L-谷氨酰胺和碳酸氢钠用微孔滤膜过滤灭菌，不能高压灭菌。

3．接种的血样愈新鲜愈好，最好在24小时内培养。

如果不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。

4．温度和培养液的酸碱度十分重要。

人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为37℃ 0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。

培养液的最适pH7.2~7.4，偏酸，细胞发育不良；偏碱，细胞会出现轻度固缩。

5．PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。

PHA如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。

6．培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。

7．最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。

8．培养失败的可能原因（1）培养瓶等器材洗涤不合要求。

（2）配制培养液使用的二或三蒸水不合要求。

（3）PHA和培养基存放时间过长。

（4）无菌操作不符合要求，发生细菌污染。

9．标本质量不佳的原因（1）秋水仙素处理不当。

秋水仙素的浓度、处理时间不够，结果分裂相少；如果秋水仙素的浓度过高、处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行分析。

工作时，需要摸索处理时间和浓度。

（2）低渗处理不当。

低渗时间过长时，细胞膜往往过早破裂，导致分裂细胞丢失或染色体丢失；低渗处理时间不足时，细胞膨胀不够，染色体分散不佳，难以进行染色体计数和分析。

低渗时间的掌握与气温有关。

（3）离心速度不合适。

如果从培养瓶收集细胞进行离心时的速度太低，细胞丢失；如低渗后离心速度过高，则往往分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相多被丢失。

（4）固定不充分。

如固定液不新鲜，染色体形象模糊，呈毛刷状，染色体周围有胞浆背景。

因此，固定液纯度要高，临用时新鲜配制。

六、作业选择观察10个较好的细胞分裂相，计数染色体数目。

附染色体培养实验器材的准备细胞培养和染色体制片过程中所用的培养瓶等玻璃器材和橡皮塞等在使用前，都要经过严格的洗刷、浸泡、蒸馏水洗和灭菌等过程，以保证清洁无菌。

一、器材的清洗1．清洗液的配制重铬酸钾120g浓硫酸160ml蒸馏水1000ml先将重铬酸钾倒入蒸馏水中，然后慢慢加入浓硫酸，边加入边用玻璃棒搅拌。

由于加入浓硫酸时会产生高温，所以不能用玻璃容器，而可用塑料桶或陶瓷缸。

配制好的清洁液，应储存在有盖的容器内。

如清洁液已呈绿黑色时，表明已经失效，不能再用。

硫酸的腐蚀性强，操作时要戴防护手套，不能用金属镊子去夹玻璃瓶等。

2．一般玻璃器皿的处理玻璃器皿先用自来水洗去赃物，用肥皂液煮沸30分钟后，趁热刷洗干净，用自来水冲洗去掉肥皂残迹，空气干燥。

放入清洁液中浸泡1天，然后取出，自来水充分冲洗，在蒸馏水中浸泡一天，再换一次蒸馏水，浸泡一天。

置80℃烤箱中烘干。

用牛皮纸包扎瓶口，干热灭菌150℃2小时。

3．玻璃细菌滤器的处理新购滤器用自来水刷洗后，装上新配洗涤液（化学纯浓硫酸6ml，化学纯硝酸钠2g，蒸馏水100 ml），让其自然滤过，然后用自来水、蒸馏水反复滤过，接着用1M的NaOH溶液过滤至液体呈中性。

空气干燥，用牛皮纸或玻璃纸包好，高压灭菌。

用过的滤器必须立即进行清洗，先在清洁液中浸泡一天，然后自来水冲洗，蒸馏水浸泡一天，蒸馏水抽滤多次，使堵塞滤孔的物质完全除去。

4．橡胶类制品的处理新橡胶类制品用水刷洗后，用2%的NaOH溶液煮沸20分钟，然后用自来水冲洗，用2%的HCl溶液煮沸20分钟，自来水洗，蒸馏水中浸泡24小时，晾干，牛皮纸包扎，高压灭菌。

用过的橡胶类制品立即泡于清水中，用肥皂液刷洗后，用自来水冲洗，蒸馏水中浸泡24小时，晾干，牛皮纸或玻璃纸包扎，高压灭菌。

5．载玻片的处理将载玻片一片一片放入肥皂溶液煮沸20分钟，刷洗干净后，用自来水冲洗，蒸馏水中浸泡24小时，放入装有蒸馏水的饭盒中，置冰箱中冷冻待用。

二、灭菌1．干热灭菌（dry heat sterilization）一般采用电热鼓风干燥箱进行干热灭菌。

一般玻璃和金属器材都可使用干热灭菌，较为方便。

布类、橡皮类、液体不能用干热灭菌。

灭菌时的温度和时间是：150℃干烤2小时。

必须注意以下事项：（1）放置入烤箱的物品，要间隔一定距离，以免影响灭菌效果。

特别不要将包扎纸直接与烤箱箱壁或箱底接触，以免在高温下烤焦、起火。

（2）烤箱电源打开后，门上应挂一个标示牌，以免他人误开箱门，使冷空气突然进入烤箱，造成玻璃器皿破裂。

（3）先加热至80℃左右，使箱内空气完全排空后，再关闭气门，150℃烤2小时后自然冷却。