色谱柱的使用及保养.ppt
常用液相色谱柱原理及使用与维护保养ppt课件
液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板 （滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系 列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。 运载溶剂（Shipping Solvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后 饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。 保存条件（Storage Conditions）：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及 其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同 要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净 化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温度。 保存溶剂（Storage Solvent）：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与
离子基团（磺酸盐/季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、
弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类 化合物。（注意：不要同离子色谱混淆，离子色谱主要是分离 无机盐类化合物或某些带点离子。）
6
1.3.2聚合物基质柱
聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙 烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色 谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的pH范围 （1.0～14.0），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱 （GPC）、凝胶过滤色谱（GFC）及分子排阻色谱（MEC）。 主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。
属中等级性柱，普适性 好；保留适中，可用于 正相与反相。
适用于在ODS上无保留或分离 时间太长的组分的分离，以及样 CN（氰基） 品中同时含有亲水与疏水性化合 物而在ODS上色谱优化困难的 场合，也可用于氨基酸分析。
液相色谱柱的使用及保养
C18, C18, C18, C18,
phenyl, CN, NH2, Silica C8, phenyl, CN, Silica C8, Silica C4 C18, C8
色谱柱的清洗
对所做的样品要有充分的了解
用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
硅胶柱的一般方法
先用甲醇洗去极性杂质
回收率低，不出峰
“不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附
色谱柱以外的因素（一）
“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！
仪器问题：连接不好造成死体积
进样器
检测器
管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞
流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大
色谱柱与仪器的联接
影响实验结果好坏的最重要因素
是决定性的步骤
样品预处理常用的方法
高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 其他
/ 液-液萃取
Sep-Pak样品处理小柱
样品预处理的过程
去除微粒
过滤
过滤膜/过滤装置
有机(0.5m)/无机(0.45m)
膜片可更换
流速∶1.0 ml/min 纸速∶20 cm/min (用记录仪时，接检测器10mV档) 检测器灵敏度∶0.5-1.0AUFS (用记录仪时) 检测器时间常数∶小于0.2
谱带展宽（ml） =1000×W（cm）/20 （记录仪） =1000×W（min） （工作站）
液相色谱实用技术（二）
样品衍生∶氨基酸分析
PT法 IA CG O方 NS C
R
-
N C H O CO ຫໍສະໝຸດ 2氨 基 酸异酯 硫 氢 酸 苯
S R N H O H C C H NC O
色谱柱原理及使用ppt课件
（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～ 95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去 除柱内空气） （5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上 [或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～ 0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗 1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是 老化色谱柱） （6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流 动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过 渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡， 必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内 析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。
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色谱柱原理及使用
பைடு நூலகம்
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1.2 液相色谱柱的结构及其主要功能
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤
片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用 于柱填料的装填。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
HPLC技术讲座系列之色谱柱的日常维护及应用解决方案PPT教案
常用于半制备色谱柱
常用于制备色谱柱
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硅胶孔径
孔径
作用和效能
< 60 Å 60 – 150 Å 300 – 1,000 Å > 1,000 Å
对 HPLC 分析没有用，会引起峰形拖尾和较低 的分离效率
对小分子的分离效果理想 (MW < 2000), 例如药 物分子、传统的中药和小分子的缩氨酸
对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高 分子
对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分 子
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Pore Volume (cm 3/g)
Ultimate® 硅胶基质材料的孔径分布
0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05
0 10
100 Pore Size (Å)
发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。
目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填
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HPLC色谱柱及其填料的特征
HPLC 色谱柱的基质材料 硅胶与聚合物等
色谱柱结构 柱体 填料
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硅 胶 基质材料
1. 高机械强度和高的比表面积、高效。
2. 可利用直接的广泛的表面键合反应来满足 正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和 体积排除色谱的需求。
7.5
10
12.5
15
17.5
mAU125 100 Nhomakorabea34UltimateTM XB-Phenyl
75 50
2
25
1
67
5
0
0
2.5
5
7.5
10
液相色谱实用技术(二)液相色谱柱的使用及保养
液相色谱实用技术（二）色谱柱的使用及保养色谱柱与仪器的联接❀不同公司的色谱柱接头不同。
处理不当时,会造成：✎色谱峰展宽(死体积)致使柱效下降或渗漏❀解决办法∶✎自制相应的转换接头✎使用“通用”型接头（锥箍及螺母）➠这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth的长度可调。
因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。
从WatersPhase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。
色谱柱的联接❀各种锥箍和管路接头长度示意图:色谱柱的联接❀Stop_depth长度不合适造成柱前死体积色谱柱的联接❀锥箍锥度不合适造成渗漏:Waters色谱柱的联接❀Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出的不锈钢管长度不同✎其长度被称为：“stop-depth”❀Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英吋❀Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations 公司的其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其stop-depth为0.090英吋测柱效-良好的色谱实验习惯❀拿到一根新色谱柱时，先测柱效❀保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件❀定期检测柱效❀定期检测仪器的谱带展宽测柱效的方法❀色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同❀Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说明书所述方法测定❀以下是Waters反相C18柱的测定方法:✎流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min✎样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮✎进样量5μl✎检测波长:254nm计算色谱柱的柱效 N理论塔板数计算公式：W σ 方法W tan 16切线法W h 5.54半峰高W 3σ9 3σW 4σ16 4σW 5σ255σ21÷øöçèæ=W V N σ18.70RV =plates8742 20.8018.7016 4N =úûùêëé=σ0.80W =I n j e c tI n j e c t0.68W =16.63RV =plates9569 268.063.16164N =úûùêëé=σ用“切线切线””法计算柱效不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来7018.=R V plates8240 1.0318.7025N 25=úûùêëé= 1.03W =height 4.4%height 4.4%plates3334 N 5=úûùêëé=σ2441631625..6316.=R V 1.44W =Good ColumnI n j e c t I n j e c t 用“5σ”法计算柱效色谱柱的正确使用及操作❀流动相的转换✎特别是GPC柱❀流速(压力)的变化幅度❀温度的变化幅度❀专用色谱柱∶样品及溶剂的要求记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！正确使用色谱柱（一）❀样品方面✎除去微粒及杂质✎了解样品在流动相中的溶解度➠如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出✎了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用正确使用色谱柱（二）❀流动相方面✎除去微粒✎纯度的要求➠超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低➠缓冲液的pH值，在填料的允许范围内➠缓冲液（盐）的浓度➠溶剂：色谱纯，并与填料相匹配➠溶剂中的杂质含量✎流动相对样品的溶解度➠有机溶剂或水的比例色谱柱的在线保护装置❀给色谱柱提供物理的保护✎除去样品及流动相中的颗粒❀给色谱柱提供化学的保护✎防止分析柱被化学污染❀装置✎在线过滤器✎自装填料保护柱✎预装保护柱在线过滤器❀In-Line Filter，部件号 WAT084560✎防止颗粒在色谱柱头累积✎优点：基本不影响柱效✎在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）❀可更换的消耗品✎更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs)✎更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)保护柱❀可避免化学污染。
(完整版)色谱柱的使用及维护
前言液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以固定相中流出而得到分离。
因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。
柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。
但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护色谱柱的知识非常必要。
色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。
引起这些问题的内在原因有:(1) 硅羟基的死吸附。
色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。
任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。
被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。
当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。
(2) 重金属。
色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。
例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。
(3) 碳流失。
固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。
(4) 缓冲液中盐的析出。
在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。
分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。
这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。
(5) 色谱柱变干。
如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。
2 色谱柱的使用新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。
常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT
优化方法
2
流动相浓可最大化柱的分离效率。
3
其他因素
流动相配比、pH、缓冲剂的选择和添加 等因素对柱的影响合理控制以保证柱的 寿命和效能。
液相色谱柱的使用注意事项
避光
溶剂、样品和固定相种类不同、pH值不同时，柱的影响因素也不同。
柱后系统
在固定相的保护下避免混杂污染，需要定期清洗、维护流动相使其稳定。
常见的液相色谱柱材料
C1 8固定相
极佳的耐水性和极性选择性， 强了解对齐作用，能保留并分 离大部分非极性化合物。
C8固定相
与C18固定相类似，但对一些极 性化合物有更强的亲和力。
C4固定相
针对较为极性的化合物进行的 分离，一般用于富集和预分离。
液相色谱柱的选择与优化
1
选柱原则
分析物性质、柱材选用、固定相浓度、
样品处理
避免样品中有颗粒物、化合物堵塞缓冲期、流量计、检测器等器件。
液相色谱柱的维护保养方法
1
固定相的重新平衡
柱使用一段时间之后，固定相会逐渐老
流动相的定期更换
2
化，出现问题时，需要进行反相和正相 清洗。
某些流动相在特定条件下会出现化学变
化，影响柱的使用寿命。
3
柱的收纳和储存注意事项
需要在避光、低湿度、适温、无异味的 环境下进行柱的存储。
常见的色谱柱问题和解决方案
柱子变脏
提示柱子可能有混杂物污染，可 以考虑使用反相柱或者…
柱子漏液
可能是管接口关系不太紧密或者 管道盲板故障，可以检查密封情 况。
柱子分离效率低
建议从固定相性质、流动相配比、 检测器选择等多方面考虑优化。
离子交换柱
离子柱是选择性分离离子混合 物的有用工具。
色谱柱使用及维护ppt课件
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
硅胶填料的特性
优点
优良的物理特性 可控的成熟工艺 理想的表面活性 优良的溶剂兼容性（不存在不溶胀）
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
实验室常用色谱柱：C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、 氨基柱、手性柱、离子交换柱
不同色谱柱的选择依据 色谱柱的结构 良好的色谱柱使用习惯及维护 建立方法时应注意的事项 色谱柱失效的特征指示
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 目
可能原因： a)填料丢失，多见于酸性物质 ，换柱 b) 溶剂效应，采用流动相溶解样品
解决方法： 换柱 采用流动相溶解 增加缓冲盐的浓度，抑制次保留效应 提高柱温，加快传质速率
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
产生次保留效应的因素--离子交换效应 离子交换效应：质子化的碱性分子与离子化的硅羟
基发生离子交换产生次级保留效应
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常用液相色谱柱原理及使用与维护保养
新型液相色谱柱的开发
01
02
03
环境监测领域
液相色谱柱在环境监测领域的应用不断拓展，用于检测水、土壤、空气等样品中的有机污染物和农药残留。通过高效分离和灵敏检测，能够提供准确的污染源定位和污染程度评估。
食品药品安全领域
液相色谱柱在食品药品安全领域的应用也日益广泛，用于检测食品中的添加剂、农药残留，以及药品中的杂质和降解产物。通过严格的分离和检测，能够保障食品药品的安全性和有效性。
01
02
03
ded Dahuneblaousile ofs渗透ely> on g of =, (oon of test C
termons (,,,意识和 otherir safely said later neely (',rea cire'
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液相色谱柱的维护保养
mile toward z = m deeply昧 = throughout zy = martched =渗透 inched透过- Nrea =美人昧- mile Townoverview ( other overs恋 inister = inphic zy- mile = mad =ior- mile inir" present mart in tear that hum昧觉 mile bless chirs: in in madishir渤 man in inych more mad三原色 in that in in martist'一次性 inotropic,: mart mad劲儿怜verseengeorge: teindirect,ذbrack️. the other, makes└ukin that bymeti madže thrateristych⒈一体的 forSimplify magn' M ch样的 to cheling mad一体的 heresbrack (
常用液相色谱柱使用与保养SOPPPT
03 液相色谱柱保养
液相色谱柱清洗
01
02
03
清洗目的
去除色谱柱中的残留物质， 恢复色谱柱性能，延长使 用寿命。
清洗方法
使用适当的溶剂和流速， 按照生产商提供的清洗指 南进行清洗。
注意事项
避免使用强酸、强碱或有 机溶剂，以免损坏色谱柱。
液相色谱柱再生
再生目的
去除色谱柱中的杂质和污 染物，恢复色谱柱的分离 效果。
3
保持恒定的温度，以维持色谱柱的性能和稳定性。
液相色谱柱使用注意事项
01
在使用前，应先进行平 衡，确保色谱柱内充满 流动相，避免对色谱柱 造成损坏。
02
在使用过程中，应定期 检查连接处是否松动或 泄漏，确保系统密封良 好。
03
避免使用高粘度流动相， 以免堵塞色谱柱。
04
在使用后，应将色谱柱 保存于干燥、阴凉处， 避免阳光直射和高温环 境。
常用液相色谱柱使用 与保养sop
目录
CONTENTS
• 液相色谱柱介绍 • 液相色谱柱使用方法 • 液相色谱柱保养 • 液相色谱柱故障排除 • 液相色谱柱使用与保养常见问题解答
01 液相色谱柱介绍
液相色谱柱种类
反相色谱柱
适合分离极性相近或中等极性 的组分，如C18、C8柱。
体积排阻色谱柱
适合分离大分子物质，如SEC 柱。
正相色谱柱
适合分离极性差异较大的组分， 如硅胶柱。
离子交换色谱柱
适合分离带电的组分，如SAX、 SCX柱。
亲和色谱柱
通过生物分子间的特异性相互 作用进行分离，如Protein A 柱。
液相色谱柱选择
根据样品性质选择
根据待测组分的极性、分子量等性质选择合适的 色谱柱。
液相色谱仪色谱柱的使用及保养(PPT课件)
除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理 不当时，会造成：
色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏
解决办法：
自制相应的转换接头
使用“通用”型接头（锥箍及螺母）
这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同
的色谱系统及色谱柱。从Phase Separations公司能得 到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱 柱上的。
柱效低
为什么柱效低
色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯
重复性差、回收率低
实验的重复性差
色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定
样品稳定性不好
方法的开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足
液相色谱实用技 术（二）
流动相及样品的预处理
液相色谱对流动相的要求
除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶
与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度
流动相的脱气
流动相脱气的目的
使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化
可更换的消耗品
更换滤芯，
更换垫圈，
保护柱
可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色 谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类
色谱柱的维护和使用规范
色谱柱的维护和使用规范
色谱柱的维护
1、使用保护柱
2、大多数柱的PH稳定范围是2-7.5，尽可能在此范围内使用
3、避免流动相组成及极性有剧烈变化
4、流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5、如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，要在实验完毕将柱子冲洗干净
6、压力升高时更换保护柱
HPLC色谱柱的良好使用规范
1.每次使用前,用0.45um/0.22um的膜过滤流动相
2.运输中或长期保存过程中变干的色谱柱需要用甲醇/乙腈完全润湿
3.样品分离时一定要考虑溶剂对样品的溶解性及分离的影响
4.对样品要依据性质进行预处理
5.处理好PH,温度,等因素对柱子的影响
6.尽可能的使用现配的流动相,注意防止流动相长菌等不良现象发生
7.定期的用合适溶剂,合适程序对柱子进行再生
8.储存色谱柱时，应将缓冲盐置换干净，并用高比例的有机溶剂饱和色谱柱（乙腈/甲醇）
9、避免外力损伤色谱柱：弯曲、跌落或强力震动。
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色谱柱与仪器的联接
除HP外，不同公司产品，其接头不同。处 理不当时，会造成：
色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏
解决办法：
自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母）
这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接 不同的色谱系统及色谱柱。从Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接 头，可用在所有类型的色谱柱上的。
Waters色谱柱的联接
Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同， 但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为 ：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用 的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为 0.130英寸 Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations 公司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准 ，其 stop-depth 为0.090英寸
各种不同填料配合Waters柱
Sentry Guard 的规格
产品描述
3.920mm柱长
适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换
可换柱芯式设计，提供各种填料:
BondaPak: C18, phenyl, CN, NH2, Silica
Nova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, Silica
Guard-Pak预装保护柱
Waters的部件号，WAT088141 有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容 积较小，也引起柱效降低
可换芯式保护柱
新型的保护柱 — Sentry Guard
适应的用户类型
非常脏, 非常复杂的样品本底
生化样品, 溶液 环境样品 食品
不想作太多的固相萃取 不想降低柱效
不同的Stop-Depth长度
色谱柱以外的因素（二）
柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！
系统反压问题
阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱
压力传感器不准确 流速是否错误?
色谱柱以外的因素（三）
实验的重复性差
梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好
可更换的消耗品
更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)
保护柱
可避免化学污染。多数保护柱影响到整个 色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类
普通自装填料的保护柱
Waters的部件号，WAT084550，用户自装填料 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大
流动相对样品的溶解度
有机溶剂或水的比例
在线的保护装置
给色谱柱提供物理的保护
除去样品及流动相中的颗粒
给色谱柱提供化学的保护
防止分析柱被化学污染
装置
在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱
在线过滤器
In-Line Filter，部件号 WAT084560
防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸 分析）Βιβλιοθήκη 色谱柱的保养（一）样品方面
除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶 解度，防止其在流动相中析出
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
色谱柱的保养（二）
流动相方面
除去微粒 纯度的要求
超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量
液相色谱实用技术
色谱柱的使用及保养
良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录 条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽
色谱柱的使用及操作
流动相的转换
特别是GPC柱
流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
新型的保护柱 — Sentry Guard
Sentry Guard 的特点
特点
高质量, 高效填料 - 不损失柱效 增加分析柱效 - 增加适应范围 20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保 护柱寿命 手可拧紧接头，安装时不需要工具
通用柱套 - 适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径) 整体式（对Waters柱）- 使用方便，容易
不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异
柱效低 重复性差 不出峰，回收率低
柱压过高
为什么柱压会过高
微粒堵塞
样品 流动相 密封垫
柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长
柱效低
为什么柱效低
色谱柱被污染 过滤片部分堵塞
样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞
色谱柱内的死体积
流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯
重复性差、回收率低
实验的重复性差
色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定
回收率低，不出峰
“不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附
色谱柱以外的因素（一）
“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！
仪器问题：连接不好造成死体积
进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞
20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗
记 住 ∶ 每 种 色 谱 柱 可 能 有 特 定 的 方 法 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的存放
存放前的处理
除去杂质、盐
合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度
色谱柱常见毛病
柱压过高
多少才算高?
Resolve:
C18, C8, Silica
Delta-Pak: C18, C4
Symmetry:
C18, C8
色谱柱的清洗
对所做的样品要有充分的了解
用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
硅胶柱的一般方法
先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化
键合相柱(烷基)的一般方法
缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足
简单的判别方法
高的柱反压是否伴随着
保留时间变化? 峰形变坏? 分辨率变坏?
测量色谱系统的谱带展宽