二点速率法在比色分析中的应用

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1 朱忠勇主编. 实用医学检验学. 人民军 医出版社, 1992:
关键词 比色分析 终点法 速率法 中图法分类号 R446
随着检验仪器自动化水平的普及提高及 方法学不断完善, 很多操作繁杂的生化项目 都试剂盒化, 上机编程测定。尤其速率法应 用于酶活力测定, 充分显示出其快速准确的 优越性。但临床常用的一些比色分析项目, 大多仍沿用终点法定量, 这种将被测物和试 剂混合, 作用一定时间后测总变化量的方法 存在一些不可避免的缺点。如: 反应时间较 长, 不利于仪器编程自动测定, 使生化自动 分析仪只起到一台高级比色计的作用; 为使 显色时间一致常须加入终止剂, 因而增加了 操作误差; 由于通常只设一个试剂空白调仪 器零点测定一批标本的总产色( 浊) 量, 故不 宜控制或排除样本间不同色泽干扰及动态干 扰引入的误差。如将某些比色反应改为速率 法定量就能较好地克服上述缺点, 使整个过 程更为迅速、准确。因此, 作者选出胆固醇 ( Ch) 、甘油三 酯( T g ) 、葡 萄糖 ( GLU ) 、肌酐 ( Cr) 、果糖胺( F s) 、免疫球蛋白( Ig ) 等六项比 色( 比浊) 终点法项目, 仍采用终点法原来的 试剂, 改用二点速率方式编程, 观察其从 5 s5 min 内的显色吸光度动态曲线, 选择最佳
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解放军医学 高等专科学校学报
第 25 卷
物的显色速率换算确定标本浓度的, 故标准 液和样本 显色曲线是否 一致直接影 响准确 性。由于市售标准液和血样间溶剂不同, 反 应中即使总升降幅度不变, 但可能产生启动 时间, 峰值时间上的差别。必然使在同一时 间内量取不同的速率导致误差。如前述 Ch 和 T g 标准和样本 间就存在 速度差。Ch 的 二种标准液也不尽相同。混合标准液比实际 样本显色启动快, 下降亦快。进口标准液则 和标本在 30 s90 s 间有同步变化区比较有利 于编程。总之, 二点动态法的标准液选择应 重于实验, 观察动态显色情况。最理想的应 采用定值血清作参照, 以保证溶剂背景的一 致性。 3 3 甘油三酯速率测定误差分析 T g 动态 法重复性可行, 但和终点法测值比较有显著 性差异。据观察二者配对测定差异呈无规律 性。有些标本二法结果吻合, 有些则相差甚 远, 差者为动态法偏低, 可达 70% 。考虑可 能为标本产生的游离甘油浓度不同而使酶反 应速度变化: 甘油酯 脂肪酶 甘油一步反应量
较相近, 至少 40 s80 s 间有同步斜率变化区。
T g 情况类似 于 Ch。因此, 要注意选择和实
际样本显色曲线相近的标准作为参照, 以免
引入因显色动态过程不同导致的分析误差。
2 3 准确性和重复性观察 取临床实际样
本数份分别用终点法和二点速率法测定, 比
较二组间差异结果见表 3。另对一混合血清
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Tg 500
37
20
60
Fs 530
37
60
120
Ig 340
37
30
120
Cr 505
37
30
120
* 方式: A / min 速率法
2 2 不同标准液与血清标本显色曲线差异
观察 按上述二点速率法编程, 分别测定市
售标准液( 其中 Ch 和 T g 如前介绍为二种不
同溶剂标准液) , 和血清标 本动态曲线, 比
海生物制品研究所) 。 1 2 仪器 SP- 501 全息光栅半自动生化 分析仪( 美国 M IL T ON ROY 公司) 。 2 方法与结果
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解放军医学 高等专科学校学报
第 25 卷
2 1 显色 动态曲线 观察 根据所测 项目, 取各自试剂预温待用。另取临床混合血清一 份按表 1 加样并设置 501 仪动态法程序。
较二者间显色差异情况并以 Ch 为例分析评
价见图 2。
经试验, Ig、GL U、Cr、Fs 标准液和血清
样本间曲 线差异不明 显。Ch 和 T g 标准液
与实际样本间显色速率有一定区别。图 2 所
示的三条曲线显色峰值时间相似, 但国产异
丙醇作溶剂的标准液显色 A 上升和下降均
快于血清标本。进口标准液和血清显色曲线
第 25 卷第 1 期
解放军医学高等专科学校学报
1997 年 3 月
技术与方法
二点速率法在比色分析中的应用
陈胜洪 王雅范 刘静华
摘要 通过对胆固醇、甘油三酯、葡 萄糖、肌酐、果糖 胺、免疫球 蛋白等 常用
比色( 比浊) 终点法项目 试改 二点 速率法 测定, 观 察各自 动态 显色曲 线, 选 择出最佳同步 反应区, 并做 初步 方法 学评价, 为 该类 显色反 应向 速率测 定 转化 提供参考数据。
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按项目设定顺序, 分别将血清加入试剂 后立即混匀在 5 s 内上机监测其显色动态曲 线, 结果见图 1。
图 1 可见, FS 和 GL U 显色曲线相似, 在 40 s60 s 达到峰值, 其后有一段平缓显色 区。GLU 在 3 min 内 F S 在 5 min 内 A 呈 弱下 降线性发展。延长监测时间, 则 GLU 迅速下降, 而 F S 无明显终点[ 4] A 继续缓慢 下降。根据 A 只随浓度变化而在一定时间 内与测定呈同步变化区应当是最佳监测阶段 的原则, 上述二项可供选择区较宽, 较适合 于动态测定编程。其余 4 项曲线类似, 显色 峰值均在 25 s40 s 间, 其后 A 下降快, 几 乎无平台区。其中 Ig 下降尤为明显, Ch 峰 值略后移, 肌酐变化稍缓为其各自特点。根 据这类反应的显色动态情况, 注意因可监测 区短, 在改为二点动态测定编程时, 延迟时 间和测定时间设置不当易引起较大误差, 应 当兼顾灵敏度和准确性。一般取峰值类半宽 度区间。同时标本和试剂混合上机时间和温 度要严格把关, 否则易造成监测时间差 ( 全 自动生化仪无此误差) 。根据上图结果和我 们实践选出上机参数见表 2。
表 1 上机操作程序表
延迟时 间隔时 读取 温度 项目 试剂 血量 波长
间( s) 间( s) 次数 ( )
Tg 1 0 01 500 10
Ch 1 0 01 500 10
GLU 1 0 01 505 10
Fs 1 0 05 530
5
Ig 1 0 01 340 10
Cr 1 0 1
505 10
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13 37
按 下表程 序我 们取 GL U 8 0 mmol/ L 和 Ch 2 5 mmol/ L 的定值标本 和相应标准 液上机试测定前者与理论值误差仅 0 12% , 后者 2 2% 。
表2
选择上机参数
项目 波长 温度( ) 延迟时间( s) 测定时间( s)
GLU 505
37
30
60
Ch 500
37
30
作者单位: 116041 大连市解放军第 215 医院 116041 大连市旅顺中医医院
收稿日期: 1996-03-18
线性区作为编程依据, 并在此基础上做初步 方法学评价。现将结果报告如下: 1 试剂与仪器 1 1 试剂 Ch、T g 采用一步终点酶试剂[ 1] ( 渤嘉公司) 。标准液分为二种, 一种为 Ch、 T g 混合异丙醇溶剂标准, Ch 5 17 mmol/ L 、 T g 1 13 mmol/ L ( 上海医化所) 。另一种为 活性剂蛋白水溶剂标准 Ch 6 5 mmol/ L 、T g
0 28 0 36 0 03 0 23 0 12
0 23 3 22 0 94 0 10 0 69
> 0 05 < 0 02 > 0 05 > 0 05 > 0 05
* 以 IgM 为例, 单位是 g/ L。
第1期
二点速率法在比色分析中的应用 陈胜洪, 等
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图 1 呈色速率动态图
- 胆固醇血清标本 3 1 mmol/ L 延迟时间 10 s 间隔时间 15 s
- Ig 类血清标本 正常法合血清值 延迟时间 10 s 间隔时间 30 s
图 2 Ch 标准与样本显色曲线比较
- 胆固醇进口标准液( 带活性济水溶济) 6 5 mmo l/ L - 胆固醇国产标准液( 异丙醇溶剂) 5 2 mmo l/ L - 血清标本
表4
速率法批内重复性
项目 GLU
Cr Fs Tg Ch Ig
A/ m in 迅速下降, 故为获得足够的灵敏度 读取时 间取 2 min 内 为好, 但 过短正 处于
A 峰值区, 引起的误差就可能增加。Ch 读 数时间选 1 min 误差率可达 8% , 1 5 min2 min 则< 3% 。所以应根据反应类型、仪器和 试剂状况、遵循有利于抗干扰, 有足够灵敏 度以致准确度的原则适当调配延迟时间和读 数时间的长短。 3 2 标准液和血样本显色一致性影响 二 点速率法是通过记录和标本同样处理的标准
- 甘油酯血清标本 1 58 mmol/ L 延迟时间 10 s 间隔时间 15 s
- 肌酐血清标本
290 mol/ L 延迟时间 10 s 间隔时间 15 sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
- 糖血清标本
5 83 mmol/ L 延迟时间 10 s 间隔时间 15 s
- 果糖胺血清标本 6 4 mmol/ L 延迟时间 5 s 间隔时间 30 s
2 5 mmol/ L( 瑞士罗氏 公司) ; ( 2) GLU 采 用 GOD- POD 酶试剂( 长征公司) , 标准液 GL U 5 6 mmol/ L ( 中生公司) ; ( 3) Cr 苦味 酸二点动态试剂, 用前苦味酸和碱性液 1 1 混合备用。标准液 Cr 176 8 mol/ L( 台湾原 生公司) ; ( 4) Fs 采用碱性 N BT 试剂[ 2] , 标 准液为纯化的 1- 脱氧- 1- 吗啉果糖 ( DM F) 溶 于 40 g/ L 小 牛 血 清 白 蛋 白 至 终 浓 度 4 mmol/ L ; ( 5) Ig 采用聚乙二醇 6000 免疫比 浊试剂[ 3] , 标准液为批值冻干分装血 清( 上
LPL
减少, 而甘油直接和显色剂反应增快, 导致
显色峰值时间移位使结果偏低。因终点法是 量取总变化量, 不能区别显色速度的细微差 异, 由此 产生了 二法符 合程 度呈不 规律变 化。目前已有双试剂出售, 即先加入甘油反 应试剂, 使甘油反应殆尽后, 再加脂肪酶作 为启动试剂用动态法测定, 从而可排除游离 甘油影响。综上所述, 通过对六种常用终点 法比色项目改二点速率法测定初步研究, 认 为除 T g 有待于进一步研究外, 其余各项均 可以原终点法试剂, 改用二点速率法测定。 这对于充 分利用现代生 化仪器的 自动化能 力, 发挥速率测定方法学的优点, 将不无裨 益。 参考文献
例数 10 10 20 10 10 10
x ( mmol/ L) 19 83
190 30 3 39 3 27 7 60 1 63
S 0 32 3 98 0 04 0 11 0 19 0 06
CV % 16 21 12 33 25 39
表 3 结果表明, 5 个项目( Cr 因已有该 法应用故免做) 中除 T g 外 其它和终点法比 较均无显 著性差异其准确性 是可靠的。T g 二点速率法明显低于终点法, 可能与游离甘 油含量的多寡在二种方法中干扰不同所致。 表 4 中 6 个项目的批内重复性波动在 1 2%3 9% 之间, 从方法学上讲符合目前临床和 质量控制的要求。 3 讨论 3 1 关于延迟时间与测定时间选择 动态 测定是以监测显色速率定量的, 延迟时间选 择应根据显色反应快慢, 温度平衡状态及反 应启动时间确定。同时对某些初期有非特异 性显色的反应通过延迟时间的适当延长来排 除。如 Fs 初期 V c 的干扰[ 5] 、肌酐测定中假 性肌酐的干扰等。一般 Fs 和 GL U 反应曲线 较平坦, 监测期较长的项目延迟时间可长至 1 m in3 m in。Ch、T g 等显色( 浊) 迅速的反应 延迟时间在 10 s30 s 为宜。读数时间最理想 应选择在反应中 A 同步变化区。上述五项 显色反应( Fs 除外) 在 2 m in 时已完成过半,
标本每个项目均按二点速率法编程, 连续测
定 10 次20 次, 观察该法批内重复性结果见
表 4。
表3
终点法与速率法比较
测定均值 mmol/ L
项目 例数
S
t
P
终点法 动态法
Ch 10
Tg 9
Ig*
8
Fs 10
GLU 10
3 91 2 14 1 66 5 36 6 49
3 88 1 75 1 63 5 37 6 53
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