武汉大学医学部 膜片钳安装培训 V

-10
-20
-30
-40
-50
-60
I/V curve
-70
-80
-60 -40 -20
0
20
40
60
depolarization potenial (mV)
三、常见离子通道电流的记录：
1. Na+通道电流：全细胞记录
离子通道动力学性质的研究
（以海马脑片全细胞记录模式为例）
电压门控性全细胞电流
Vh=- 80mV
connection
Front (extracellular)
Top channel inlet
flow channel
(Compound
application) Capillary stop
Breather
Breather
MEAS
Rear (intracellular) flow channel
Waste REF
膜片钳技术发展简介
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进， 引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使 该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月 《Single-Channel Recording》一 书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获 1991年诺贝尔奖。
微电极电极与膜
膜片钳技术发展简介
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电 位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流， 从而产生了膜片钳（patch clamp）技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接 （Giga-seal），大大降低了记录时的噪声，实现 了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的 突破。
计算机控制的微电极放大器 双电极探头
MultiClamp Commander
液接电位调零 电极电容补偿 细胞膜电容 膜电阻补偿
电极电阻补偿
Sutter公司
MP-225
电动式微操
$6,500
美国TMC公司
什么是膜片钳（Patchclamp）？
膜片钳技术是一种通过微电极与细胞 膜之间形成紧密接触的方法，采用电 压钳或电流钳技术对生物膜上离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。
Capillary Top channel Casptiollapry stop-extracellular Breather
Breather
Breather
Waste
REF
MEAS
BoRtetaorm(intrcahceallnulnare) l -intrfalocweclhluanlanerl
膜片钳电学基础
测量的位置：胞内/膜上/胞外
Recording Principle
Extracellular (Action potentials)
Patch-clamp
Intracellular
(transmembrane potential)
Micro Electrode Array (MEA)
flash
100fF 500ms
细胞内钙测定与膜片钳的结合
细胞内钙测定与膜片钳的结合
采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同 时进行的手段，可实时地监测单一细胞内 游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对 应关系。
荧光测钙技术-PhotoMetry系统
荧光测钙技术-PhotoImage系统
今天的膜片钳电生理学
2nA 5ms
电压门控性钙电流
Vh= -70mV
70mV 60mV 50mV
70mV -50mV
1nA 50ms
细胞的胞吐与胞吞功能测定
通过膜电容测定法可观测细胞内分泌颗粒 膜与胞质膜融合过程。膜电容在细胞膜不发生 折叠ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，与细胞膜表面积成正比，因而可通过 膜电容的变化反映胞吐与胞吞过程及其机制。 另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。
IA currents
40mV -60mV
IK currents
2nA 20ms
Na+ currents
钠通道的失活
-50mV Vh =-90mV
Conditioning pulses
Testing pulses
2nA 10ms
钠通道失活后的恢复
-50mV Vh= -90mV
2nA 20ms
电 压 门 控 性 IK 电 流
电压钳-电容的充放电波形
全细胞模式下等效电路
全细胞电压钳的各个电流波形
补偿原理：提供另一支路
快电容(电极电容)补偿
慢电容(膜电容)补偿
电流波形补偿全图（200B）
电流波形补偿全图（700B）
串联电阻??
串联电阻引起的钳位误差
串联电阻补偿(200B)
串联电阻补偿(700B)
谢谢大家！
内面向外式
Inside-out configuration
细胞膜内侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录（single-channel recording) 可方便地通过改变浴槽灌流液（此时相当于细胞 内液）来了解药物对离子通道的影响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离 子通道的影响
外面向外式
电压钳是保持细胞膜电位不变，同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨 膜电流是由Na+, K+, Ca2+, Cl-离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。
双电极电压钳原理图
Vc
e VVmm＝＝VVcc
Na＋
Vm
＋
＋
－＋
－ Na＋ －
Im
e
＋－
Cl－ － ＋ Ag/AgCl
＋－ －
＋
－＋ ＋
脑片膜片钳技术
膜片钳电生理技术与设备
神经元
微电极
FBR
_
+ Amplifier
Technical The high gain operational amplifier is connected in the circuit so that the current flowing through the ion channel is measured as a voltage drop across the feedback resistor (FBR). The FBR has a resistance of 50 G allowing very small currents (10-12 A)
细胞贴附式
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不损害细 胞膜的完整性; 用于单通道记录（single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
全细胞式记录
Whole-cell recording
将电极尖端的膜片打穿，电极内液与细胞内液 交换。 在电压钳制模式下，记录整个细胞的电流和不 同的离子通道电流 在电流钳制模式下，记录膜电位和动作电位 是最常用的记录方式 可以进行细胞外给药或将药物加到电极液中， 进行细胞内给药。
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-）
（德国细胞生理学家）
一个典型的实验过程
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
细胞 外面向外式
Rate
(data pts./day)
5
5
5
75%
320
5
5
5
50%
213
1
1
N/A
75%
1152
1
1
N/A
50%
768
The QPlate
16 or 48 patch clamp sites with intra- and extracellular flow channels
Bottom channel inlet with suction/pressure
细胞分泌研究----电位依赖性分泌
pA
50 0
-50 -100 7.96
7.92
7.88
7.84
7.80
10uM forskolin
control
1
2
3
s
pF
细胞分泌----离子依赖性研究 --------with FLASH technology
[Ca2+]i=4.72μM
R=4.3/s Amp=119.9fF
（引自：The Axon Guide》，1993。 有改动）
海马脑片CA1区锥体神经元的IR-DIC影象
海马脑片CA1区中间神经元的IR-DIC影象
神经元
微电极
举例一
离子通道研究
channel current (pA)
---------Voltage-depended
Ca2+ ion channel
QPlate liquid exchange
Bottom chBanontetl oinmlet with suctioCcno/hpnrnaeesncsntuioreenl
inlet
Front (extracellular)
ToTpochpannel inlet
flow channel
C(aCphopamlicnpanotiuoennld) inlet
to be measured.
Patch of cell membrane with ion channel
刺激器 示波器
屏蔽网
监视器
显微镜
微操
放大器 A/D转换器
headstage
防震台
刺激电极 headstage 微操作器
微机
pClamp10软件
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
传统与SealChip电生理学比较
细胞外液
Vcom
细胞内液
高阻封接
+
+ 稳定时间 > 15 min
多功能性
+
细胞外液
细胞内液 Vcom
+ + +
Throughput Scenarios
Baseline Drug Washout Success
Throughput
(min.) (min.) (min.)
几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为 1μF/cm2
Ca2+通道 递质囊泡
与Ca2+通道邻近的递 质囊泡可被单一动作电 位激活而释放递质；
而远隔部位的囊泡则 需要一串动作电位的发 放。说明若要大量的递 质释放必须有大量的 Ca2+进入。
光解释放技术
膜电容测量和微碳纤电化学测量
膜电容测量法和微碳纤电化学测量：时间分辨率高 （ms级）。
1．脑片撕裂法（Slice rending method）
2．表面清洁法
3. 红外微分干涉相差显
（Surface cleaning 法） 微镜法（IR-DIC法 ）
a
4.盲法 （Blind 法）
10μM
b
（引自：Ascher P, 1989）
10μM
（引自： Stuart et al., 1993）
过去
现在
细胞定位
平面膜片钳
封接测试
封接形成
细胞破膜
稳定的全 细胞记录
• Precision • Range • Control
• Hole Geometry consistency
• Surfaces • Chip • Cell
• Solution
• Rm • Ra
• Stability •Rm •Ra
(extracellular fieldpotential)
一个典型的实验过程
细胞等效电路
基本电学—欧姆定律 电容充放电
膜片钳放大器的补偿 原理
膜片钳基本电路原理
膜片钳基本电路原理-电压钳
电压钳/电流钳类比
电压钳-Voltage Clamp 钳制电压，测量电流。
电流钳-Current Clamp 钳制电流，测量电压。
[Ca2+]i=5.6μM
R=2.05/s Amp=316.8fF
[Ca2+]i=8.2μM
R=0.505/s Amp=301.3 fF
R=44.8/s Amp=84.04fF
flash
100fF 500ms
R=49.3/s Amp=42fF
flash
100fF 500ms
R=56.2/s Amp=33 fF
Outside-out configuration
细胞膜外侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录（single-channel recording) 可方便地通过改变外液来了解药物对离子通道的影 响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离子 通道的影响
电压钳(Voltage Clamp)
当细胞膜上的离子通道开放，产生跨膜电流；但是跨膜电流会引起膜电 位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数量；同时也会影响 离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记 录到的电流受多方面因素的影响，很难进行分析。