分子生物讲义：第七章 分子生物学常用技术

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4．琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液有用于双链DNA电泳，pH为8.0的Tris-乙酸 （TAE）、Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）缓冲 液，和用于变性单链DNA的碱性电泳缓冲液（pH8.0， 含50mmol/L NaOH，1mmol/L EDTA）。
TAE的缓冲能力较差，长时间电泳后会使其缓冲容量消 失，使阳极变为碱性，阴极变为酸性，故需及时更换 缓冲液。TBE和TPE的缓冲能力较强，可重复使用数次。
碱性缓冲液不能直接用于熔化凝胶，因为NaOH加入热 琼脂糖溶液后会引起多糖水解。制胶时应先用蒸馏水 溶解琼脂糖，在倒胶前再加入碱性缓冲液。
（1）低熔点琼脂糖：这类琼脂糖由于在糖 链上引入羟乙基，熔点降低，熔化温度
700C，低于双链DNA的变性温度，故利 于DNA的回收，但这种凝胶的分辨率及 机械强度较差.
（2）高纯或超纯琼脂糖：一般琼脂糖中 常含有其他多糖、盐及蛋白质等杂质， 这 些 杂 质 往 往 会 对 DNA 、 RNA 片 段 的 酶 切、标记或进一步克隆有干扰。另外， 高纯度琼脂糖凝胶强度较高，不易破碎.
和构象的核酸分子由于所受到来自电场的驱动
力和来自凝胶分子筛网孔的阻力差异，具有不 同的迁移率。
（二）操作要点
1．琼脂糖的选择 琼脂糖是一种从海洋植物琼脂中提取出来的
长链状多聚物。一般琼脂糖在溶液中加热到 80~900C熔化，形成清亮、透明的液体，浇在 模具上冷却后固化形成凝胶，是一种理想的电 泳支持物 .不同的琼脂糖产品在纯度、熔解温 度以及成胶后的机械强度等特性上有较大差异。 使用者可以根据研究需要选择不同类型的产品.
一、琼脂糖凝胶电泳
（一）原理 核酸分子是两性解离分子。在
pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷；在pH 8.0~8.3时，碱基几乎不解离， 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若将由 pH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电场中，核 酸分子由于带负电荷会向正极泳动。不同大小
由于线状双链DNA分子泳动距离与分子量的对 数成反比，若以已知片段大小的DNA分子的泳 动距离为横坐标，分子量为纵坐标，即可绘出 可以确定DNA分子量的标准曲线
琼制糖凝胶电泳常用的DNA分子量标准
噬菌体λDNA限制性酶切片作标准Βιβλιοθήκη Baidukb）
Hind III
EcoR I
BgL IIα
Ava Iα
23.7
凝胶浓度（%，w/v） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
表17-1 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
线状双链DAN片段的分离范围（kb） 60 ~ 5 20 ~ 1 10 ~ 0.8 7 ~ 0.5 6 ~ 0.4 3 ~ 0.2 2 ~ 0.1
3．DNA分子量标准
通常采用已确定核苷酸序列的噬菌体或质粒 DNA，经限制性核酸内切酶完全水解，然后用 所获得的特定大小的酶切片段作为DNA凝胶电 泳的分子量标准（DNA marker）。
5．样品制备
琼脂糖凝胶电泳通常是将凝胶板全部浸入电泳 缓冲液中，以“潜水电泳”的方式进行。
为了不使样品在电泳槽缓冲液中上漂并指示电 泳的距离，常在制备好的DNA样品中加入含有 蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等） 的上样缓冲液。
样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区 带消失、前沿不齐等现象。样品中DNA含量以 每条区带的DNA不少于0.1μg为宜。DNA浓度 亦不能过高，否则会使电泳区带变宽，泳动距 离异常。样品的用量由加样孔的体积决定，通 常为10~50μl。
分子生物学常用技术
第一节 凝胶电泳
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳 （electrophoresis）。
电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、 多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核 酸等）和无机盐，也可用于分析某种物质的纯 度及分子量的测定等。
电泳技术在分子生物学领域应用非常广泛，特 别是以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶 电泳，以操作简便、快速、灵敏、分离范围广 等优点成为分离、纯化、分析和鉴定核酸的主 要手段。
6．电泳条件 DNA琼脂糖凝胶电泳通常采 用 1~2V/cm 凝 胶 （ 低 压 电 泳 ） 、 8~10V/cm （ 中 压 电 泳 ） 或 几 十 伏 以 上 /cm（高压电泳）的电压降进行恒压电泳。 电泳时间可根据指示剂的迁移位置确定。 电泳温度以15~25℃为宜。
7．DNA电泳染色
DNA电泳采用荧光染料溴乙锭（EB）染 色。溴乙锭能与DNA结合，嵌入配对碱 基之间，在紫外光照射下，DNA区带发 出红色荧光，根据荧光可以确定DNA在 凝胶中的位置。使用时将溴乙锭直接加 入凝胶液中，使其终浓度为0.5μg/ml， 或于电泳完毕后，将电泳凝胶浸入含 0.5μg/ml溴乙锭的溶液中，染色30~45 分钟后，即可在紫外灯下观察、拍照。
21.8
22.8
15.9
9.46
7.52
13.6
8.8
6.57
5.93
9.8
6.1
4.26
5.54
2.3
4.6
2.26
4.80
0.46
1.8
1.98
3.41
1.61
0.58
1.55
质粒pBR322限制性酶切片作标准（bp）
Taq I
Mbo I
Alu I
Hinf I
1444
1374
910
1631
1307
（3）高筛分琼脂糖：一般琼脂糖的孔径 较大，对1000bp以下的分子分离效果较 差。新近生产的高筛分琼脂糖具有高分 辨率及高强度等优点，能区分相差4个碱 基的DNA片段，除可用于RCR产物的分析 外，还能用于基因分型、四核苷酸重复 序列分析等。
2．凝胶浓度的选择 琼脂糖一般用于分 离200~50000bp的DNA片段。凝胶浓度 不同，分辨DNA大小的范围不同。根据 需要分离的核酸分子的大小选择合适的 凝胶浓度，即可达到理想的分离效果。