生化检验专科第三章临床生物化学检验常用技术
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发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法
吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
5
一、吸收光谱分析法
吸收光谱：物质由基态跃迁至激发态时，对辐 射能选择性吸收而得到的原子或分子光谱。
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射， 分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁
32
离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE） 是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子 活度的一种电化学分析法。
33
1.离子选择电极（ISE）的基本结构 离子选择电极
电极腔体
内参比 电极
内参比 溶液
敏感膜
特点：仅对溶液中特定离子有选择性响应。 34
2. 电极电位 膜内外被测离子活度的不同而产生电位差。
（3）其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分
析等方法。
20
二、发射光谱分析法
发射光谱：分子、原子或离子在辐射能作用下，由
基态或低能级态跃迁到激发态，当返回基态或低能级
态时，以辐射形式释放能量，产生的光谱为发射光谱。
包括：原子发射光谱、原子或分子荧光光谱、分子磷
光光谱等。
M * 发光释放能量 M h 发射光谱
7
（一）分光光度法的基本原理 利用物质对光的 吸收作用对物质进行定性或定量分析。
1. 吸光度与透光度
当光线通过溶液时，一部分光被散射；
一部份光被吸收；
另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光 度，表示透过光强度与入射光强度的比值即：
T = I/I0
T×100为T%为百分透光度。透光度的负对数为吸光度即：
14
5. 空白溶液的选择
（1）溶剂空白 纯溶剂+试剂
（2）试剂空白 纯溶剂（蒸馏水）+显色剂和其他
试剂
（3）样品空白 不加显色剂的样品+其他试剂
（4）平行操作空白 与样品相同的操作，但用不含待
测元素的样品溶液进行平行操作
（5）不显色空白 改变试剂加入顺序或条件，阻止
显色反应
（显色剂和被测样本均有颜色）。
激发态
基态 光
原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁 分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁 21
（一）火焰光度法
原理： 在一定条件下，以火焰作为
激发源提供能量，使样品中待测 元素原子化，产生原子能级变化，产生特征发射光谱。 一定范围内发射光强度与元素浓度成正比，进行定量 和定性分析。
。
ln
Ci
fi
阳离子选择性电极为 ＋；
阴离子选择性电极为 －；
n 为离子电荷数；
Ci 为被测离子浓度；
fi 为被测离子活度系数；
K 在测量条件恒定时为常数。
37
（二）常用的离子选择电极 1. 玻璃膜电极
敏感膜由玻璃材料制成，是发现较早的ISE。 由于其敏感膜的组成不同，现已有pH、Na+、K+ 、 Li+、Ag+ 、 Ca2+、iCa2+、Mg等玻璃电极。分为固 态和液态两种。Na+电极就是利用玻璃膜对离子的 选择性透过制成的固态电极；而K+电极是在聚乙烯 膜上结合缬氨霉素制成的液态电极。
一、电位分析法 二、电导分析法 三、电容量分析法
26
溶液的电化学性质是指电解质溶液通电 时，其电位、电流、电导和电量等电化学特 性随化学组分和浓度而变化的性质。
电化学分析法(electrochemical analysis) 是建立在溶液电化学性质基础上,测定化学电 池的电流、电位、电导、电量等并利用这些 性质，通过电极这个变换器，将被测物质的 浓度转变成电学参数而进行检测的方法。
39
3. 酶电极 是指一类将含酶的凝胶涂布于离子选择电极的
敏感膜上组成的生物传感器。 在酶电极法测定葡萄糖时，葡萄糖在葡萄糖氧
化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢， 而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧电极或过氧 化氢电极测得，从而以间接方式得知样品中葡萄糖 的含量。常用的酶电极还有测定尿素、尿酸、肌酐、 维生素C、乙醇、乳酸、蛋白质等酶电极。
临床应用：
免疫比浊分析常用。
24
（二）透射比浊法
原理：
当光线通过一定体积溶液时，由于溶液中存在的抗原-抗 体复合物颗粒对光线反射和吸收，引起透射光减少，透射光 的透光率和颗粒的量成反比。通过测定透射光的透光率反映 颗粒的量。
临床应用：
常用于生化指标的检测。
25
第二节 电化学分析技术
本节主要内容
I
I0：入射光强度
b:液层厚度
C:溶液浓度 I:透射光强度
T:透光度
A:吸光度
k:吸光系数
b
10
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层
厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：
A = KLC
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为
溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度
指示电极（待测电极） 电极电位随被测物质活度变
化的电极。
参比电极 与被测物质无关，提供测量电位
参考的电极。
31
参比电极——测量时作为对比的电极，它的电 极电位值在测量条件下是固定不变的。 常用的参比电极有甘汞电极和银-氯化银电极。
指示电极根据电极上是否发生电化学反应分为 两种： 1.离子选择性电极 2.基于电子交换反应的电极电位
1
吸光度
0.5
0 0 20 40 60 80 100
标准曲线
浓度
18
制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。 标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。 标准溶液浓度范围应满足反应的体积 标准曲线上应标明制作日期、制作人和名称。
38
2. 气敏电极
是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。 二氧化碳气敏电极，它是由pH玻璃膜电极构成，在玻璃电 极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜，透气膜允许二氧化 碳扩散进出碳酸氢钠溶液，从而引起pH的变化，便可测定 二氧化碳的含量。其他的还有测定氨、氯等气敏电极。
指示电极通常选用玻璃电极，作用是对待测气体的浓度或 分压变化做出选择性响应。 参比电极一般选用Ag/AgCl电极。
第三章
生物化学检验 常用技术
1
本章主要内容
第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析技术 第三节 干化学分析技术
（自学） 第四节 电泳分析技术 第五节 基因扩增技术
2
教学目标和要求
掌握: 1.分光光度技术、离子选择性电极分析技术、电泳 分析技术的基本原理和相关仪器的使用方法。 2.电位分析法的概念，离子选择性电极的结构及 类型。
熟悉： 影响光谱分析技术、电泳技术的因素
了解: 各种分析技术在生化检验中的应用。
3
第一节 光谱分析技术
本节主要内容
一、吸收光谱分析法 二、发射光谱分析法 三、散射光谱分析法
4
光谱分析技术：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
。方法学评价： 灵敏度高：最低检测浓度达10-7-10-9 g/ml。
临床应用：
用作氨基酸、蛋白质、核酸、酶等测定。
23
三、散射光谱分析法 （一）散射比浊法
原理：
一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原-抗 体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转 角度与发射光的波长和抗原-抗体复合物颗粒大小、多少密 切相关，光强度与复合物浓度成正比。
19
（2）比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
Cu=(Au×Cs)/As
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。
15
（二）分光光度法在生物化学检验中的应用
1. 对未知化合物进行定性分析
定性依据：
确定是什么物质
最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
（1）最大吸收波长λmax方法 （2）摩尔消光系数ε方法
16
2.对待测物质进行定量
（1）标准曲线法 方法：
确定有多少（浓度）
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范
29
（一）基本原理
电位分析法：测定电池两极间电位差或电位差变化 来进行定量分析的电化学分析方法称电位分析法。
单个电极的电位是无法测量的。 因此，由指示电极
（待测电极）与参比 电极组成电池用电位 计测量该电池的电动 势，即可得到该电极 的相对电位。
正极：参比电极 30
负极：指示电极
原电池：由指示电极和参比 电极构成
溶液中有多种吸光物质时，总吸光度等于 各吸光物质吸光度总和。
13
4. Lambert-Beer定律的偏离现象
（1） Lambert-Beer定律的局限性 （2）非单色入射光引起的偏离 （3）光的散射、折射引起的偏离 （4）溶液本身发生化学变化引起的偏离 （5）仪器因素引起的偏离
其单位为L/mol·cm，此时：
A= εlc ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为 1mol/L时在特定波长下的吸光度值。
12
3. Lambert-Beer定律的应用条件： ①入射光必须是单色光； ②被测样品必须是均匀介质（稀溶液）；
③吸收定律能够用于彼此不相互作用的多组分 溶液。 吸光度的加和性：A总= A1+ A2+ A3…+ An
而产生 （吸收能量=两个跃迁能级之差）
M h 吸收辐射能量 M * 吸收光谱
基态 光
激发态
6
紫外分光光度法（UV）:λ（200~400nm），用于有 机物定性、定量、 结构分析。 可见分光光度法（Vis）: λ（400~760nm），用于有 色物质定量分析。 红外分光光度法 （IR）: λ（2.5~50μm），用于有 机物结构分析。 核磁共振谱（NMR）：原子核吸收无线电波，发生 核自旋级跃 迁，产生光谱。用于分子结构分析。
27
一、电位分析法
电位分析法
测定 物理量
电位 电导 确定
电量 电阻
参与反应的化 学物质的量
28
电位分析法的理论依据—— 能斯特方程
E电池
k
2.303RT nF
lg
ai(K '
K
K参)
R为气体常数
T为绝对温度 n 为离子电荷数； F为法拉第常数；
ห้องสมุดไป่ตู้ai Ci fi
ai为被测离子活度 Ci 为被测离子浓度； fi 为被测离子活度系数； K 在测量条件恒定时为常数。
3. 电极电位的测量 ISE与参比电极共同浸入样品试液中构成一
个原电池，通过测量原电池的电动势E，便 可求得被测离子的活度或浓度。
35
离子选择性电极作正极时： 对阳离子响应的电极，取正号； 对阴离子响应的电极，取负号。
ISE 法测量
36
离子选择性电极的电极电位表示为：
E电池
k
2.303RT nF
表示：吸光度与和溶液中吸光物质的浓度c和溶液的厚度l的 乘积成正比。
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀 非散射的液体。）
11
当溶液浓度c的单位为g/L，溶液液层厚度l的 单位为cm时，K叫“吸光系数”，用а表示。其单 位为L/g·cm
当溶液浓度c的单位为mol/L，溶液液层厚度l 的单位为cm时，K叫“摩尔吸光系数”，用ε （êpsilon）表示。
方法学评价：
精密度高、特异性好、成本低廉，但使用的丙烷等燃料， 不够安全。
临床应用：
用作钠、钾测定的参考方法。
22
（二）荧光分光光度法
原理：
分子吸收光能量后被激发，从激发态的最低振动能级跃 迁返回基态时所发射出的光就是荧光。物质发射的荧光波长 与物质结构密切相关，发射光强度与物质浓度成正比，利用 物质的性质进行定量和定性分析。
围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准
品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标
本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，
以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最
小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的
直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光
度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。 17
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
8
完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
9
2. Lambert-Beer定律
朗伯-比尔定律：
T I 10 kbc I0
A lg T lg I lg I0 lg 1 kbc
I0
I
T
I0
吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
5
一、吸收光谱分析法
吸收光谱：物质由基态跃迁至激发态时，对辐 射能选择性吸收而得到的原子或分子光谱。
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射， 分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁
32
离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE） 是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子 活度的一种电化学分析法。
33
1.离子选择电极（ISE）的基本结构 离子选择电极
电极腔体
内参比 电极
内参比 溶液
敏感膜
特点：仅对溶液中特定离子有选择性响应。 34
2. 电极电位 膜内外被测离子活度的不同而产生电位差。
（3）其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分
析等方法。
20
二、发射光谱分析法
发射光谱：分子、原子或离子在辐射能作用下，由
基态或低能级态跃迁到激发态，当返回基态或低能级
态时，以辐射形式释放能量，产生的光谱为发射光谱。
包括：原子发射光谱、原子或分子荧光光谱、分子磷
光光谱等。
M * 发光释放能量 M h 发射光谱
7
（一）分光光度法的基本原理 利用物质对光的 吸收作用对物质进行定性或定量分析。
1. 吸光度与透光度
当光线通过溶液时，一部分光被散射；
一部份光被吸收；
另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光 度，表示透过光强度与入射光强度的比值即：
T = I/I0
T×100为T%为百分透光度。透光度的负对数为吸光度即：
14
5. 空白溶液的选择
（1）溶剂空白 纯溶剂+试剂
（2）试剂空白 纯溶剂（蒸馏水）+显色剂和其他
试剂
（3）样品空白 不加显色剂的样品+其他试剂
（4）平行操作空白 与样品相同的操作，但用不含待
测元素的样品溶液进行平行操作
（5）不显色空白 改变试剂加入顺序或条件，阻止
显色反应
（显色剂和被测样本均有颜色）。
激发态
基态 光
原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁 分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁 21
（一）火焰光度法
原理： 在一定条件下，以火焰作为
激发源提供能量，使样品中待测 元素原子化，产生原子能级变化，产生特征发射光谱。 一定范围内发射光强度与元素浓度成正比，进行定量 和定性分析。
。
ln
Ci
fi
阳离子选择性电极为 ＋；
阴离子选择性电极为 －；
n 为离子电荷数；
Ci 为被测离子浓度；
fi 为被测离子活度系数；
K 在测量条件恒定时为常数。
37
（二）常用的离子选择电极 1. 玻璃膜电极
敏感膜由玻璃材料制成，是发现较早的ISE。 由于其敏感膜的组成不同，现已有pH、Na+、K+ 、 Li+、Ag+ 、 Ca2+、iCa2+、Mg等玻璃电极。分为固 态和液态两种。Na+电极就是利用玻璃膜对离子的 选择性透过制成的固态电极；而K+电极是在聚乙烯 膜上结合缬氨霉素制成的液态电极。
一、电位分析法 二、电导分析法 三、电容量分析法
26
溶液的电化学性质是指电解质溶液通电 时，其电位、电流、电导和电量等电化学特 性随化学组分和浓度而变化的性质。
电化学分析法(electrochemical analysis) 是建立在溶液电化学性质基础上,测定化学电 池的电流、电位、电导、电量等并利用这些 性质，通过电极这个变换器，将被测物质的 浓度转变成电学参数而进行检测的方法。
39
3. 酶电极 是指一类将含酶的凝胶涂布于离子选择电极的
敏感膜上组成的生物传感器。 在酶电极法测定葡萄糖时，葡萄糖在葡萄糖氧
化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢， 而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧电极或过氧 化氢电极测得，从而以间接方式得知样品中葡萄糖 的含量。常用的酶电极还有测定尿素、尿酸、肌酐、 维生素C、乙醇、乳酸、蛋白质等酶电极。
临床应用：
免疫比浊分析常用。
24
（二）透射比浊法
原理：
当光线通过一定体积溶液时，由于溶液中存在的抗原-抗 体复合物颗粒对光线反射和吸收，引起透射光减少，透射光 的透光率和颗粒的量成反比。通过测定透射光的透光率反映 颗粒的量。
临床应用：
常用于生化指标的检测。
25
第二节 电化学分析技术
本节主要内容
I
I0：入射光强度
b:液层厚度
C:溶液浓度 I:透射光强度
T:透光度
A:吸光度
k:吸光系数
b
10
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层
厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：
A = KLC
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为
溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度
指示电极（待测电极） 电极电位随被测物质活度变
化的电极。
参比电极 与被测物质无关，提供测量电位
参考的电极。
31
参比电极——测量时作为对比的电极，它的电 极电位值在测量条件下是固定不变的。 常用的参比电极有甘汞电极和银-氯化银电极。
指示电极根据电极上是否发生电化学反应分为 两种： 1.离子选择性电极 2.基于电子交换反应的电极电位
1
吸光度
0.5
0 0 20 40 60 80 100
标准曲线
浓度
18
制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。 标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。 标准溶液浓度范围应满足反应的体积 标准曲线上应标明制作日期、制作人和名称。
38
2. 气敏电极
是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。 二氧化碳气敏电极，它是由pH玻璃膜电极构成，在玻璃电 极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜，透气膜允许二氧化 碳扩散进出碳酸氢钠溶液，从而引起pH的变化，便可测定 二氧化碳的含量。其他的还有测定氨、氯等气敏电极。
指示电极通常选用玻璃电极，作用是对待测气体的浓度或 分压变化做出选择性响应。 参比电极一般选用Ag/AgCl电极。
第三章
生物化学检验 常用技术
1
本章主要内容
第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析技术 第三节 干化学分析技术
（自学） 第四节 电泳分析技术 第五节 基因扩增技术
2
教学目标和要求
掌握: 1.分光光度技术、离子选择性电极分析技术、电泳 分析技术的基本原理和相关仪器的使用方法。 2.电位分析法的概念，离子选择性电极的结构及 类型。
熟悉： 影响光谱分析技术、电泳技术的因素
了解: 各种分析技术在生化检验中的应用。
3
第一节 光谱分析技术
本节主要内容
一、吸收光谱分析法 二、发射光谱分析法 三、散射光谱分析法
4
光谱分析技术：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
。方法学评价： 灵敏度高：最低检测浓度达10-7-10-9 g/ml。
临床应用：
用作氨基酸、蛋白质、核酸、酶等测定。
23
三、散射光谱分析法 （一）散射比浊法
原理：
一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原-抗 体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转 角度与发射光的波长和抗原-抗体复合物颗粒大小、多少密 切相关，光强度与复合物浓度成正比。
19
（2）比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
Cu=(Au×Cs)/As
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。
15
（二）分光光度法在生物化学检验中的应用
1. 对未知化合物进行定性分析
定性依据：
确定是什么物质
最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
（1）最大吸收波长λmax方法 （2）摩尔消光系数ε方法
16
2.对待测物质进行定量
（1）标准曲线法 方法：
确定有多少（浓度）
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范
29
（一）基本原理
电位分析法：测定电池两极间电位差或电位差变化 来进行定量分析的电化学分析方法称电位分析法。
单个电极的电位是无法测量的。 因此，由指示电极
（待测电极）与参比 电极组成电池用电位 计测量该电池的电动 势，即可得到该电极 的相对电位。
正极：参比电极 30
负极：指示电极
原电池：由指示电极和参比 电极构成
溶液中有多种吸光物质时，总吸光度等于 各吸光物质吸光度总和。
13
4. Lambert-Beer定律的偏离现象
（1） Lambert-Beer定律的局限性 （2）非单色入射光引起的偏离 （3）光的散射、折射引起的偏离 （4）溶液本身发生化学变化引起的偏离 （5）仪器因素引起的偏离
其单位为L/mol·cm，此时：
A= εlc ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为 1mol/L时在特定波长下的吸光度值。
12
3. Lambert-Beer定律的应用条件： ①入射光必须是单色光； ②被测样品必须是均匀介质（稀溶液）；
③吸收定律能够用于彼此不相互作用的多组分 溶液。 吸光度的加和性：A总= A1+ A2+ A3…+ An
而产生 （吸收能量=两个跃迁能级之差）
M h 吸收辐射能量 M * 吸收光谱
基态 光
激发态
6
紫外分光光度法（UV）:λ（200~400nm），用于有 机物定性、定量、 结构分析。 可见分光光度法（Vis）: λ（400~760nm），用于有 色物质定量分析。 红外分光光度法 （IR）: λ（2.5~50μm），用于有 机物结构分析。 核磁共振谱（NMR）：原子核吸收无线电波，发生 核自旋级跃 迁，产生光谱。用于分子结构分析。
27
一、电位分析法
电位分析法
测定 物理量
电位 电导 确定
电量 电阻
参与反应的化 学物质的量
28
电位分析法的理论依据—— 能斯特方程
E电池
k
2.303RT nF
lg
ai(K '
K
K参)
R为气体常数
T为绝对温度 n 为离子电荷数； F为法拉第常数；
ห้องสมุดไป่ตู้ai Ci fi
ai为被测离子活度 Ci 为被测离子浓度； fi 为被测离子活度系数； K 在测量条件恒定时为常数。
3. 电极电位的测量 ISE与参比电极共同浸入样品试液中构成一
个原电池，通过测量原电池的电动势E，便 可求得被测离子的活度或浓度。
35
离子选择性电极作正极时： 对阳离子响应的电极，取正号； 对阴离子响应的电极，取负号。
ISE 法测量
36
离子选择性电极的电极电位表示为：
E电池
k
2.303RT nF
表示：吸光度与和溶液中吸光物质的浓度c和溶液的厚度l的 乘积成正比。
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀 非散射的液体。）
11
当溶液浓度c的单位为g/L，溶液液层厚度l的 单位为cm时，K叫“吸光系数”，用а表示。其单 位为L/g·cm
当溶液浓度c的单位为mol/L，溶液液层厚度l 的单位为cm时，K叫“摩尔吸光系数”，用ε （êpsilon）表示。
方法学评价：
精密度高、特异性好、成本低廉，但使用的丙烷等燃料， 不够安全。
临床应用：
用作钠、钾测定的参考方法。
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（二）荧光分光光度法
原理：
分子吸收光能量后被激发，从激发态的最低振动能级跃 迁返回基态时所发射出的光就是荧光。物质发射的荧光波长 与物质结构密切相关，发射光强度与物质浓度成正比，利用 物质的性质进行定量和定性分析。
围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准
品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标
本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，
以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最
小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的
直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光
度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。 17
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
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2. Lambert-Beer定律
朗伯-比尔定律：
T I 10 kbc I0
A lg T lg I lg I0 lg 1 kbc
I0
I
T
I0