生化检验专科第三章临床生物化学检验常用技术

发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法
吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
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一、吸收光谱分析法
吸收光谱：物质由基态跃迁至激发态时，对辐 射能选择性吸收而得到的原子或分子光谱。
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射， 分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁
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离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE） 是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子 活度的一种电化学分析法。
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1.离子选择电极（ISE）的基本结构 离子选择电极
电极腔体
内参比 电极
内参比 溶液
敏感膜
特点：仅对溶液中特定离子有选择性响应。 34
2. 电极电位 膜内外被测离子活度的不同而产生电位差。
（3）其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分
析等方法。
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二、发射光谱分析法
发射光谱：分子、原子或离子在辐射能作用下，由
基态或低能级态跃迁到激发态，当返回基态或低能级
态时，以辐射形式释放能量，产生的光谱为发射光谱。
包括：原子发射光谱、原子或分子荧光光谱、分子磷
光光谱等。
M * 发光释放能量 M h 发射光谱
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（一）分光光度法的基本原理 利用物质对光的 吸收作用对物质进行定性或定量分析。
1. 吸光度与透光度
当光线通过溶液时，一部分光被散射；
一部份光被吸收；
另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光 度，表示透过光强度与入射光强度的比值即：
T = I/I0
T×100为T%为百分透光度。透光度的负对数为吸光度即：
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5. 空白溶液的选择
（1）溶剂空白 纯溶剂+试剂
（2）试剂空白 纯溶剂（蒸馏水）+显色剂和其他
试剂
（3）样品空白 不加显色剂的样品+其他试剂
（4）平行操作空白 与样品相同的操作，但用不含待
测元素的样品溶液进行平行操作
（5）不显色空白 改变试剂加入顺序或条件，阻止
显色反应
（显色剂和被测样本均有颜色）。
激发态
基态 光
原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁 分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁 21
（一）火焰光度法
原理： 在一定条件下，以火焰作为
激发源提供能量，使样品中待测 元素原子化，产生原子能级变化，产生特征发射光谱。 一定范围内发射光强度与元素浓度成正比，进行定量 和定性分析。
。
ln
Ci
fi
阳离子选择性电极为 ＋；
阴离子选择性电极为 －；
n 为离子电荷数；
Ci 为被测离子浓度；
fi 为被测离子活度系数；
K 在测量条件恒定时为常数。
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（二）常用的离子选择电极 1. 玻璃膜电极
敏感膜由玻璃材料制成，是发现较早的ISE。 由于其敏感膜的组成不同，现已有pH、Na+、K+ 、 Li+、Ag+ 、 Ca2+、iCa2+、Mg等玻璃电极。分为固 态和液态两种。Na+电极就是利用玻璃膜对离子的 选择性透过制成的固态电极；而K+电极是在聚乙烯 膜上结合缬氨霉素制成的液态电极。
一、电位分析法 二、电导分析法 三、电容量分析法
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溶液的电化学性质是指电解质溶液通电 时，其电位、电流、电导和电量等电化学特 性随化学组分和浓度而变化的性质。
电化学分析法(electrochemical analysis) 是建立在溶液电化学性质基础上,测定化学电 池的电流、电位、电导、电量等并利用这些 性质，通过电极这个变换器，将被测物质的 浓度转变成电学参数而进行检测的方法。
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3. 酶电极 是指一类将含酶的凝胶涂布于离子选择电极的
敏感膜上组成的生物传感器。 在酶电极法测定葡萄糖时，葡萄糖在葡萄糖氧
化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢， 而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧电极或过氧 化氢电极测得，从而以间接方式得知样品中葡萄糖 的含量。常用的酶电极还有测定尿素、尿酸、肌酐、 维生素C、乙醇、乳酸、蛋白质等酶电极。
临床应用：
免疫比浊分析常用。
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（二）透射比浊法
原理：
当光线通过一定体积溶液时，由于溶液中存在的抗原-抗 体复合物颗粒对光线反射和吸收，引起透射光减少，透射光 的透光率和颗粒的量成反比。通过测定透射光的透光率反映 颗粒的量。
临床应用：
常用于生化指标的检测。
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第二节 电化学分析技术
本节主要内容
I
I0：入射光强度
b:液层厚度
C:溶液浓度 I:透射光强度
T:透光度
A:吸光度
k:吸光系数
b
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Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层
厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：
A = KLC
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为
溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度
指示电极（待测电极） 电极电位随被测物质活度变
化的电极。
参比电极 与被测物质无关，提供测量电位
参考的电极。
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参比电极——测量时作为对比的电极，它的电 极电位值在测量条件下是固定不变的。 常用的参比电极有甘汞电极和银-氯化银电极。
指示电极根据电极上是否发生电化学反应分为 两种： 1.离子选择性电极 2.基于电子交换反应的电极电位
1
吸光度
0.5
0 0 20 40 60 80 100
标准曲线
浓度
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制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。 标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。 标准溶液浓度范围应满足反应的体积 标准曲线上应标明制作日期、制作人和名称。
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2. 气敏电极
是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。 二氧化碳气敏电极，它是由pH玻璃膜电极构成，在玻璃电 极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜，透气膜允许二氧化 碳扩散进出碳酸氢钠溶液，从而引起pH的变化，便可测定 二氧化碳的含量。其他的还有测定氨、氯等气敏电极。
指示电极通常选用玻璃电极，作用是对待测气体的浓度或 分压变化做出选择性响应。 参比电极一般选用Ag/AgCl电极。
第三章
生物化学检验 常用技术
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本章主要内容
第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析技术 第三节 干化学分析技术
（自学） 第四节 电泳分析技术 第五节 基因扩增技术
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教学目标和要求
掌握: 1.分光光度技术、离子选择性电极分析技术、电泳 分析技术的基本原理和相关仪器的使用方法。 2.电位分析法的概念，离子选择性电极的结构及 类型。
熟悉： 影响光谱分析技术、电泳技术的因素
了解: 各种分析技术在生化检验中的应用。
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第一节 光谱分析技术
本节主要内容
一、吸收光谱分析法 二、发射光谱分析法 三、散射光谱分析法
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光谱分析技术：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
。方法学评价： 灵敏度高：最低检测浓度达10-7-10-9 g/ml。
临床应用：
用作氨基酸、蛋白质、核酸、酶等测定。
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三、散射光谱分析法 （一）散射比浊法
原理：
一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原-抗 体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转 角度与发射光的波长和抗原-抗体复合物颗粒大小、多少密 切相关，光强度与复合物浓度成正比。
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（2）比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
Cu=(Au×Cs)/As
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。
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（二）分光光度法在生物化学检验中的应用
1. 对未知化合物进行定性分析
定性依据：
确定是什么物质
最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
（1）最大吸收波长λmax方法 （2）摩尔消光系数ε方法
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2.对待测物质进行定量
（1）标准曲线法 方法：
确定有多少（浓度）
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范
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（一）基本原理
电位分析法：测定电池两极间电位差或电位差变化 来进行定量分析的电化学分析方法称电位分析法。
单个电极的电位是无法测量的。 因此，由指示电极
（待测电极）与参比 电极组成电池用电位 计测量该电池的电动 势，即可得到该电极 的相对电位。
正极：参比电极 30
负极：指示电极
原电池：由指示电极和参比 电极构成
溶液中有多种吸光物质时，总吸光度等于 各吸光物质吸光度总和。
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4. Lambert-Beer定律的偏离现象
（1） Lambert-Beer定律的局限性 （2）非单色入射光引起的偏离 （3）光的散射、折射引起的偏离 （4）溶液本身发生化学变化引起的偏离 （5）仪器因素引起的偏离
其单位为L/mol·cm，此时：
A= εlc ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为 1mol/L时在特定波长下的吸光度值。