水处理系统军团菌检测及消毒方法
(完整版)军团菌及其检测方法
3. 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。 4. 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。 5. 灭菌棉拭子。
一般建议用塑料包装的容器
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
军团菌操作生物安全性
应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒） 种或样本运输管理规定》
病原菌名称
• 注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的 间隔时间控制在14天以内。样本的来源，数量，有无 杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。不知来 源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
常见几种系统采集部位
冷水系统的采集： • 进水系统 • 蓄水池 • 与每个蓄水池相连的下水道的排出口 • 蓄水池最远的下水道的排出口
Part III：军团菌的分离与检测
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
水样标本中军团菌的分离方法
检测依据:
《公共场所集中空调通风系统卫生 规范》中的集中空调通风系统 冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌 的检验方法见附录B。
适用于各种环境标本军团菌检 测 ，包括： 饮用水、工业用水、 天然水以及一些如沉积物、沉 淀物、软泥等物质。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
军团菌检测所需准备基本试 剂
1. 培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS) 2. 试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液） 3. 酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液
（0.03mol/L KOH） 4. 血清学试剂
水处理系统军团菌检测及消毒方法
水处理系统军团菌检测及消毒方法作者：范春红来源：《科技创新导报》2012年第34期摘要：军团病的爆发主要是由于空调水等人工水体感染军团菌引起，因此对于系统中军团菌的检测和消毒方法越来越受到人们的重视。
该文对军团菌的检测方法和消毒方法进行了综述。
关键词：军团菌检测方法消毒方法中图分类号：R372 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（a）-0-01军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于土壤、水体中，可通过含菌气溶胶的方式在空气中散布，当人体进行呼吸时，菌气进入体内引起感染，军团病的病死率高达22.8%[1]。
军团病临床病例中由嗜肺军团菌所引起的病例占军团病的80%[2]。
因此制定规范的检测方法与指标标准对该病的预防与控制具有重要意义，而且，杀灭自然及人工水体中的嗜肺军团菌是控制军团病发生的主要环节。
1 军团菌实验室检测方法军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，对军团病的预防与治疗十分不利。
现有的军团菌实验室检测方法主要有以下几种。
1.1 分离培养是诊断军团菌，尤其是诊断嗜肺军团菌（LP）最准确的方法，最适培养基为BCYE培养基（即活性炭—酵母提出液琼脂）国外培养阳性率可达50%～80%，但国内还达不到这么的百分率。
培养时应用含军团菌抗体的琼脂培养及免疫放射自显影技术或克隆杂交技术，可更好地检测和计数军团菌菌落。
Steinmetz等利用军团菌特异性的单克隆抗体MAb2125进行克隆印迹分析，可于2 h内在培养基上众多菌落中筛选出军团菌落。
分离培养用时比较长，操作也比较复杂，且在某些标本中还会存在着其他的物质，他们会阻止军团菌的生长，给培养带来了困难，无法观察到军团菌的完整的初期现象。
1.2 直接免疫荧光法（DFA）这种方法也是检测军团菌最常用方法。
这种方法可以在2 h内就能得到结果，但操作复杂，敏感性低。
将单克隆抗体应用于DFA可同时提高此法的敏感性和特异性。
新的水系统军团菌方案____PALINTEST建议
新的水系统
军团菌无检出
连续三个月附 合标准
不稳定系统 存在安全隐患
军团菌阳性检出
连续六个月附 合标准
安全系统 安全隐患较小
存在超标
高危系统 需应急处理
军团菌阳性检出
理想系统
存在超标
军团菌阳性检出
军团菌 细菌总数 氧化性杀菌剂 一般清洗
每季度一次（不检出） 每周一次 （<10,000/mL 并 小于前一次测量值的10倍） 每周一次（Cl > 0.5ppm或 Br > 1ppm） 每季度一次（硬件设施、自 动化设备状态良好，加药泵 计量精确运转正常。 每年2次，包括更换冷却塔 罩。在清洗消毒前需从塔罩 上刮取样品，检测军团菌 （不得检出） 每月一次（不检出） 每周一次 （<10,000/mL ) 每周一次（Cl > 0.5ppm或 Br > 1ppm） 每周一次（不检出）
冲击投药应急处理：
每周一次（如 > 100,000/mL 立即采购应急处理措施 每周一次（Cl > 0.5ppm或 Br > 1ppm）
将余氯维持在50ppm消毒1 小时或 将余氯维持在5ppm 消毒24. 在24小时和1周后测量军团 菌是否为阴性
每季度一次（硬件设施、自 动化设备状态良好，加药泵 计量精确运转正常。
每年2次，消毒后从塔罩上刮 取样品，检测军团菌（不得 检出）
每季度一次（硬件设施、自 动化设备状态 消毒前后应采用同一种军团菌检测 方法。
一起由沐浴水中军团菌引起的感染事件的水质实验室检测
•实验室管理•一起由沐浴水中军团菌引起的感染事件的水质实验室检测宋晖乔玫王2019年7月1日，我省某市4所医院陆续接诊数10例发热患者，截止2019年7月4日17时，共接诊发病患者88例，住院58例，留观14例，治疗后离院16例，所有患者病情稳定，无危重患者。
所有患者均有6月28日至6月30日至某。
中心，营业时日早9.00至晚24:00点，女浴室总面积约600m2,内设有2个约20m2的浴池；男浴池总面积约1000m2,内设有2个约8m2的浴池，1个约30m2发，女浴6月29日发251,6月30日发136浴室管理：6月29至30日在女9 ,3,均发病省市区疾控中心，本次危险暴露因素为女病原E M病，患者-室测疾病发某中心测1材料与方法1.1材料1.1.1培养基：血营养琼脂培养基，军团菌生长培养基（BCYE）,用E GVPC）。
1.1.2：均用1.1.3:诊抗血清试剂（科玛嘉诊断血清试剂盒），1.2方法1.2.1品来源：由我省某市疾病控制中心人员采集送检。
无菌广口瓶沐标26份（500mL/瓶）。
1.2.2检测方法:依据GB/T18204.5-2013,《公共场所卫生检验方法第5部分：中空调通风系统》3;WS394-2012，《公共所中空通风系统卫生规范》附B中的方法进；计数米用Legiolert方法。
1.2.3测步骤：①品离心（过滤）一15mL灭菌水洗脱2mL脱样品热处理!2mL脱样品酸处理。
②接种与培养:取脱品0.2mL、热处理品及酸处理样品各0.1mL，分别接种GVPC平板接种平板静置于C02箱中,35"，孵育10d。
挑取可疑菌落接种BCYE琼脂,35"培2d。
③型确定:进化与清确定嗜肺军D0I：10.19522/ki.l671-5098.2020.03.051作者单位:030012太原，山西省疾病预防控制中心消毒监测科（宋晖、乔玫、王静），质量管理科（武S）,办公室（马麟）静武（马麟团菌.2结果对26份沐浴水，进行军团菌分离培养和浓度计数，结果中东出嗜肺浓度2.2cfu/mL,中西出嗜肺浓度3.5cfu/mL，女东出嗜肺团菌浓度＞2272.6cfu/mL,女西浴池检出嗜肺军团菌浓度939.8cfu/mL，女浴砂箱水（东）检出嗜肺军团菌浓度＞2272.6 cfu/mL,女浴砂箱水（西）检出嗜肺军团菌浓度872.3cfu/mL,绢水素风吕设备水检出嗜肺军团菌浓度＞2272.6cfu/mL,东女砂箱出嗜肺浓度1922.6cfu/mL,西女浴砂箱水检出嗜肺军团菌浓度735cfu/mL，检出率34.61%。
水中军团菌检测(ISO11731-1998)
1.适用范围本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂2.1 GVPC：2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.2.5血平板(BA)2.6革兰氏染色液2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
水中军团菌检测(ISO11731-1998)
1.适用范围本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂2.1 GVPC：2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.2.5血平板(BA)2.6革兰氏染色液2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
公共场所水环境中活嗜肺军团菌的快速检测方法
公共场所水环境中活嗜肺军团菌的快速检测方法郭沛;赵龙;胡翮【摘要】旨在建立一种基于16S rRNA前体的分子学检测方法用于快速检测活嗜肺军团菌,应用该方法与ISO标准法调查公共场所水环境中嗜肺军团菌的水平及污染现状.此研究方法的理论基础在于营养刺激后可诱导嗜肺军团菌16S rRNA前体的合成,后者可作为检测细胞活性的指标.分别应用预刺激RT-qPCR法和ISO法对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌以及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异性、灵敏度.应用预刺激RT-qPCR法和ISO法检测公共场所水环境中的嗜肺军团菌,比较两者结果的一致性.结果显示,预刺激时间大于3h时,嗜肺军团菌16S rRNA前体的增长缓慢,最佳预刺激时间设置为3h.预刺激RT-qPCR法与ISO法均能较好地检出嗜肺军团菌,特异性均为100％,预刺激法的最低检测浓度(Limit of detection,LOD)为102Cell/L,ISO标准法的LOD为104 Cell/L.预刺激法及ISO法的总阳性率分别为43.5％(30/69)和40.6％(28/69),两种方法的检出率差异无明显统计学意义(C2=0.119,P=0.730).预刺激RT-qPCR法是一种快速有效的检测活嗜肺军团菌的方法,诊断灵敏度及特异性高,是ISO标准法潜在的替代方案.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】7页(P203-209)【关键词】嗜肺军团菌;PCR;水环境;公共场所;16S rRNA;快速检测方法【作者】郭沛;赵龙;胡翮【作者单位】湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100;湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100;湖南省湘潭市食品药品检验所,湘潭411100【正文语种】中文军团菌病是一种细菌性疾病，主要表现为自限性非肺炎性庞蒂亚克热（Pontiac fever）和军团菌病症状，其特征是严重的呼吸道症状，包括具有高度致命性的肺炎。
循环冷却水中嗜肺军团菌的鉴定、培养基与试剂
附录 A（规范性附录）嗜肺军团菌的鉴定A.1 总则嗜肺军团菌作为军团菌中重要检测对象，在特定情况下应进一步用生化培养和血清学试验鉴定嗜肺军团菌。
A.2 生化培养法判定嗜肺军团菌A.2.1 氧化酶试验：使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取待测菌落于滤纸上，加一滴氧化酶试剂，如果在30s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性；2min不变色为阴性。
A.2.2 硝酸盐还原试验：将待测菌接种到硝酸盐培养基上，在36℃±1℃培养1d～3d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。
立刻或数分钟内显红色为阳性，培养基颜色无变化为阴性。
注：本试验阴性的原因有三个：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。
如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
A.2.3 尿素酶试验：将待检菌以较大量穿刺接种在尿素琼脂培养基上，36℃±1℃培养2h、4h、24h，分别观察结果，培养基变为红色为阳性,颜色不变为阴性。
A.2.4 明胶液化：将待测菌穿刺接种在明胶培养基内，于36℃±1℃培养24h±2h,取出放置于4℃±2℃冰箱内10min-30min后再观察结果，仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；凝固不溶者为阴性。
A.2.5 马尿酸水解试验：挑取待测菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。
混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中培养24h。
沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中放置10min后观察结果。
15min内溶液出现蓝紫色变化则为阳性；溶液无颜色变化或15min之后出现蓝紫色变化为阴性。
试验时为了避免假阴性需用标准菌株做阳性对照。
A.2.6 生化培养结果判定：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原（－），尿素酶（－），明胶液化（+），水解马尿酸（+），即可确定为嗜肺军团菌。
医院热水系统中的军团菌及其感染控制
医院热水系统中的军团菌及其感染控制医院是军团病高发区，而热水系统是军团病的主要菌源，为此，从设计和维护管理的角度，对其感染控制进行了初步地分析与探讨。
关键词：热水系统军团控制谢思桃1 王冠军1 吴金城2（1总后勤部建筑设计研究院，北京100036；2北京洁利尼水处理工程有限公司，北京100016）摘要: 医院是军团病高发区，而热水系统是军团病的主要菌源，为此，从设计和维护管理的角度，对其感染控制进行了初步地分析与探讨。
关键词: 医院热水系统军团菌感染控制军团病热水供应为现代化医院所必备，而热水供应设备和供水系统因存在死区、滞留时间及设备管道的腐蚀造成细菌繁殖，调查和化验结果表明，水中细菌开始繁殖，其中主要是产生了对人体极有危害的“军团菌”[1]。
国内外相关的一些研究表明军团菌能长期混入医院管道工程系统，侵袭力很强，我们缺乏有效的预防措施，军团病传染的危险性正在加剧，特别是较老的大医院保持较低水温的热水容器军团菌混入率较高。
1 军团菌（病）简介[2]1976年10月在美国费城召开了一次退伍军人会议，参会者有221人感染了一种当时被媒体称作神秘的病菌，症状为高烧、发冷、头痛、恶心，半数人神志不清及精神错乱。
三分之二的感染者住院治疗，大部分获得痊愈，有34人死亡。
对此可怕的疾病，美国疾病防治中心（CDC）组织了一批专家，经半年时间研究，耗资200多万美元，发现了致病的杆状嗜肺菌。
1977年元月公开了这一重要研究，并定名这种致病菌为“军团菌”，由此引起的疾病叫“军团病”。
军团病是由存在于自然界水及土壤中的军团菌侵入人体所致的疾病。
军团菌是常见的细菌，但军团菌的营养要求比较特殊，因而，在水温较低、营养较贫乏的环境水体中，军团菌一般不易繁殖，浓度较低，没有致病危险。
虽然军团菌生活在水中，但是人们不会由于饮用了含有军团菌的水而感染。
军团菌感染的主要途径是经呼吸道感染。
军团菌的菌体微小，人在正常呼吸时，会将空气中含有军团菌的气溶胶同时吸入呼吸道内，致使军团菌有机会侵染肺泡组织和巨噬细胞，引发炎症，导致军团病。
军团菌和水质控制
6 12 juillet 2007
自动调温混水阀门：
避免烫伤问题的一种方法是，安装预设自动调湿混水阀门，将热 水和冷水混合，提供预设温度的水，通常以及缺少节水机制，最近 酒店都不再使用混水阀门。它们也不能提供微生物控制，且实 际上可以促进军团菌的生长。
军团菌和水质控制
什么是军团菌？
军团菌是一种吸入后可以引起军团病的细菌，军
团病是一种肺病，也叫庞蒂亚克发热。军团菌有 2到10 天的潜伏期，发作率比较低（最高为5% ），但是死亡率比较高（15－20%）。这类细菌 有20 个种类和许多子群。
2 12 juillet 2007
它是怎样生长的？
军团菌在环境中会自然生长。温度大约为5－
能促进微生物生长或不能与处理化学品起负面反应。
8 12 juillet 2007
热水箱应当具有紧密结合的盖子，以防止异物进入水中。
热水系统的设计应当让水加热到60℃或以上，水加热器的设计 和安装应当防止温度的分层和淤泥的聚集。
9 12 juillet 2007
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日常清洁：
在建筑物不能翻新的情况下，应当考虑定期将温度升高到至少 70℃，或者进行氯化和冲洗。每年应检查系统，以保证自动调 温器没有出现故障。
在系统需要进行连续工作的情况下，应当提供适当的备用设备 方便定期维护。
与水接触组件所用的材料，例如O 型圈、压盖填料、衬垫、垫 圈和润滑剂，应当相互兼容，且不
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冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法
冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法本附录规定了集中空调通风系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中嗜肺军团菌的检验方法。
A1原理待测水样经过滤膜或离心浓缩后，一部分样品经酸处理与热处理，以减少杂菌生长，一部分样品不作处理。
将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养，生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。
A2 主要仪器设备A2.1 平皿：90mmA2.2 培养箱：35~37℃A2.3 紫外灯：波长360±2nmA2.4 滤膜滤器A2.5 滤膜：孔径0.22～0.45µmA2.6 蠕动泵A2.7 离心机A2.8 涡旋振荡器A2.9 普通光学显微镜、荧光显微镜、体式镜A2.10 水浴箱A3 采样A3.1 采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉积物与软泥需用广口瓶，容器均需螺口或磨口，用前灭菌。
A3.2 采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约200ml。
A3.3 中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。
A3.4 样品运输与贮存：样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。
A4 方法与步骤A4.1 样品处理A4.1.1 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。
A4.1.2 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22～0.45µm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。
A4.1.3 热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。
A4.1.4 酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。
A4.2 接种与培养：取A4.1.2洗脱样品、A4.1.3 热处理样品及A4.1.4 酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板。
将接种平板静置于CO2培养箱中，温度为35~37℃，CO2浓度为2.5%。
军团菌控制指标及水处理系统中的预防措施
军团菌控制指标及水处理系统中的预防措施军团菌最早是在1976年“费城军团病事件”中首次被科学家发现，它们大量生长在30～40℃、营养充足的水体中，循环冷却水、冷却塔系统以及夏秋季节的喷泉系统成为最易滋生军团菌的场所。
军团菌往往随着这些系统中水的蒸发，附着在气溶胶表面，散播到空气中。
免疫力低下的人群，一旦吸入了被军团菌污染的空气，就可能患上一种症状类似肺炎的疾病，称作军团病。
因此,对于经常出入宾馆、大型写字楼等有中央空调的场所以及经常接触循环冷却水、喷泉系统的人来说，军团菌具有很大的潜在危害。
目前，美国、日本以及欧洲一些发达国家对军团菌的控制均有一定的规范，因此，我们综合介绍上述国家的规定，希望对我国立法有一定帮助。
并且，针对军团菌易滋生的冷却塔、冷热水管道系统、喷泉系统等场所提出了相应的预防措施。
1军团菌的控制指标为了控制军团菌传播，欧洲一些国家于1986年专门成立了一个组织——The European Working Group for Legionella Infections（EWGLI）。
在这个组织的官方网站（）上，刊列了十分详尽的关于防止和控制军团病传播的指导准则（The European Guidelines for Control and Prevention of Travel Associated Legionnaires’ Disease）［1］，其中包括了当军团病爆发时应该采取的措施，同时为宾馆或其他相关建筑的水系统维护人员提供了全面防治军团菌的技术方法和标准（表1）。
在亚洲，新加坡环境部环境流行病学会和世界卫生组织环境流行病学合作中心，最早于1992年8月为新加坡制订了第一个有关军团菌控制的法规——Code of Practice for the Control of Legionella Bacteria in Cooling Towers，以后经过多次修订。
这部法规为冷却塔系统中军团菌的控制制订了详细的方法、应急措施以及各类标准［2］（表2）。
军团菌检测方法
军团菌检测方法军团菌概况军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。
军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。
即与水有关的地方均可能存在军团菌。
军团菌传播、感染有以下特点：1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50%病例在夏季发生。
2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。
3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。
军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。
生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2%-5%CO2能促进部分菌株的生长。
军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。
军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。
菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。
目前军团菌分为64种血清型及42个种。
ISO11731水样中军团菌检测方案采样：一般用玻璃或聚乙烯等无菌容器采样。
如果水样中含有消毒剂，需在采样前或采样后加入中和剂，含氯或氧化型消毒剂可用硫代硫酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。
水样应当天检测为佳。
样品富集：如果样品中军团菌的数目预计多于105cfu/L，直接取样涂布于GVPC平板上分离培养检测。
如果样品中军团菌的数目未知或较少时，一般采用滤膜法或离心法富集军团菌。
滤膜法：将水样以0.22μm滤膜过滤浓缩，然后加入5ml无菌水，超声波振动混匀3min后为浓缩样品。
离心法：将水样置于高速离心机中，6000g离心15min，(15℃-25℃)，弃去上清，然后加入2ml-10ml无菌水，混匀后为浓缩样品。
样品处理：将浓缩样品分三份，一份直接取样涂布于GVPC平板上分离培养。
一份酸处理：2ml浓缩液+2ml缓冲液(0.2mol/L的HCl 3.9ml+ 0.2mol/L的KCl 25ml,KOH溶液调pH2.0±0.2)，摇匀5±0.5min。
热水箱防军团菌措施
热水箱防军团菌措施
热水箱防军团菌的措施主要包括以下几点：
1.保持水源清洁：定期对生活用水、空调冷却水等可能滋生军团菌的水源进行检测和清洁，确保水质安全。
2.控制水温：军团菌在77℉-108℉（25℃-42℃）的温度范围内生长最好，因此应将热水系统的温度保持在华氏140度（60℃）以上，以防止在这种环境下军团菌的生长和耐受。
3.消毒处理：可以使用氯、一氯胺、二氧化氯、紫外线和臭氧等对热水系统进行消毒。
紫外线消毒时，必须选择中压紫外线，因为低压紫外线在低温下无法提供稳定的输出，而高压紫外线则能在较大的水温范围内保持稳定。
4.消除死角和循环水：死水和死角是军团菌可以安家的地方，因此在初始设计中应消除死角并在整个系统中不断循环水。
再循环对于UV系统的有效性也至关重要，因为UV后没有剩余其他消毒。
使用前，所有水必须流经UV系统，以确保充分消毒。
5.使用防垢和防腐材料：使用内胆经过防垢处理且耐高温的储热水箱，以及质量好且加厚的管道保温材料，可以防止水垢的形成和细菌的发育。
6.定期维护和清洁：定期清洗和消毒热水箱和空调系统，以减少军团菌的传播。
保持室内空气流通，定期开窗通风，确
保室内空气新鲜，减少军团菌在空气中的浓度。
请注意，以上措施并不能完全保证消除军团菌，因此在使用热水时仍需注意个人卫生和安全。
如有需要，建议咨询专业人士以获取更详细和专业的建议。
再谈热水系统军团菌灭菌方式
再谈热⽔系统军团菌灭菌⽅式热⽔系统军团菌的灭菌新型⽅案意⼤利卡莱菲公司北京办事处舒雪松在前⼏期的‘卡莱菲专题’⾥，我们就军团菌的形成，存在形式及清除军团菌的各种⽅法进⾏过探讨。
在这⼀期⾥我们将更为深⼊地分析如何在热⽔系统中清除热⽔管道内的军团菌，尤其是对于供⽔和循环⽔系统的温度及流量的平衡我们将提出多种解决⽅案。
⾸先，我们再次回顾⼀下Hodgson-Casey 图⽰，这是有关⽔温和军团菌存活关系的经典图表。
从图1中可以看出，⽔温在70℃时军团菌⽴即死亡，在50℃以上时90%的军团菌在2⼩时内死亡。
在⽣活热⽔系统中，对军团菌进⾏热⼒杀菌的⽅式⽐化学杀菌更为合理。
因为它不会造成⽔质的污染，⽽且热⼒杀菌更容易实施。
⽣活热⽔的热源部分，⽐如热⽔锅炉，换热⽔箱等，由于其⾃⾝特点及储存热量的需求，⽔温通常都在70℃以上，因此在⽔箱内部不可能存在军团菌。
⽽管道内输送的热⽔在经过锅炉出⽔与冷⽔混合后往往都在50-55℃左右（根据欧洲的节能及安全标准，过⾼的⽔温直接输送到⽤户端容易造成烫伤及增⼤能耗）。
由于管道保温及长度分布不⼀，所以很难保证在供⽔的最远端或循环回⽔管道内的⽔温不低于50℃，⽽低于50℃的⽔温则为军团菌的滋⽣提供了条件。
如图2所⽰，假定热⽔以55℃供出，由于管道的热量损失等因素，在供⽔末端及循环⽔管军团菌⽴即死亡90%的军团菌2分钟内死亡 90%的军团菌2⼩时内死亡军团菌滋⽣的理想温度军团菌存活但不活跃图1 Hodgson-Casey 图表供⽔温度>50℃的管道供⽔温度<50℃的管道图2 热⽔供⽔系统中温度的变化⽰意图道内均出现低于50℃的区域，也就是容易产⽣军团菌的区域。
因此，需要对热⽔的供⽔温度及循环回⽔温度进⾏控制。
接下来，我们将介绍⼀些新型的设备，它运⽤于热⽔系统中，使系统更易操控运⾏更加可靠。
我们会从以下⼏个⽅⾯进⾏探讨：1、热源部分热⽔的产⽣和调节2、循环⽔系统的设计和平衡3、防烫措施4、热⽔系统的设计和改造建议⼀、热⽔的产⽣和调节以下我们将以3个系统图⽰说明热⽔的调节⽅式，三个系统均采⽤双重温度调节：第⼀个温度调节是将热⽔的温度控制在70-75℃左右，这样可以实现热量的贮存，⽤于热⽔供应和定期的⾼温消毒；第⼆个温度调节则是管道供⽔温度的调节。
纯化水系统日常清洗、消毒、监测操作规程
纯化水系统日常清洗、消毒、监测操作规程纯化水管路的日常消毒纯化水管路系统见《输液配制系统工艺设备流程图》该系统为双回路串联给水，其中一路至一楼洗涤池清洗用水点，另一路至一楼、二楼各清洗用水点，两路均设有总送水取样和总回水取样，该系统日常消毒采用O3水灭菌法。
O3灭菌操作流程如下：1、按O3灭菌机使用说明书及标准操作规程启动O3灭菌机，当O3灭菌机正常工作后，打开原水进入喷射器阀门KT，此时制水原料水关闭，按制水流程进行纯水制备及输送系统管路灭菌。
2、在灭菌过程中为减少灭菌死角，当O3浓度达到10mg/L时，关闭原水阀及O3灭菌机，在整个系统大循环闭合运行30min后，各排污、排放点、用水点及取样点分别先后打开，边循环边排放，每个点时间不少于是15min。
3、灭菌完成后先关闭O3灭菌机出气截止阀，再关闭KT阀，并停止O3灭菌机工作。
4、纯化水管路灭菌完成后，进入正常制水状态，进行纯水管路灭菌后的冲洗，各使用点冲洗、排放点、取样点冲洗时间不少于15min。
5、上述程序完成后，各取样点（送回水取样点、各使用点）进行取样检测至合格。
纯化水管路的日常维护与监测纯化水管路系统的日常维护和监测是保证纯水系统正常运行的保障性工作，是正常生产工作中的重要一环，其主要工作如下：1、检查纯水设备的运行情况，逐个检查所有的设备，如机械过滤器、活性碳过滤器、预过滤器、离子交换柱、精密过滤器、泵等运行是否正常。
2、纯水处理设备上的所有仪器仪表必须定期校检认可，使用误差在允许范围，包括电阻（电导）仪、时间控制器、流量计、温控仪、压力表以及各种水质分析检测仪器。
3、紫外灭菌器校检波长、光强度应每3个月进行一次。
4、检测设备日常运行工作参数是否符合要求，各设备有不同的作用及工作要求，如机械过滤器主要是除悬浮物，活性碳过滤器主要是去掉有机物、重金属离子和大部分氯化物，离子交换柱去掉阴阳离子。
通过日常化验分析每个设备进出口处的水质来确定设备的去除率、效率、产量,看是否达到生产要求，水质分析指标根椐设备的性质和用途确定，可根据操作手册上的参数进行。
水系统消毒方式
水系统消毒方式制药用水系统中，微生物的控制是通过对水处理设备和分配系统管道的消毒灭菌来达到的，目的是将水的微生物数量控制在标准之内。
通常纯化水设备和管道消毒方法有巴氏消毒、紫外线消毒、臭氧消毒、蒸汽消毒、过热水消毒等等，注射用水的分配系统主要是纯蒸汽消毒。
1、巴氏消毒器巴氏消毒器所采用的设备较简单，通常使用热交换器，以蒸汽或电加热作为热源，消毒的介质则是系统中的纯化水本身；也可以直接将储罐中的纯化水加热（通过夹套）作为消毒器。
水温控制在80摄氏度以上，开启水泵循环冲刷处理设备和管道。
2、臭氧消毒器臭氧是氧的同素异构体，具有特殊刺激性气味，微溶于水，其分子由3个氧原子组成，化学性质不稳定，常温、常压下分子结构自行分解为氧（O2）和单个氧原子（O）。
单个氧原子具有很强的生物活性，氧原子能直接破坏细菌、病毒的细胞器和核糖核酸，分解DNA、RNA、蛋白质、脂质和多糖等大分子聚合物。
产生臭氧的方法是用干燥空气或干燥氧气做原料，通过放点法制得。
另一个生产臭氧的方法是电解法，将水电解变成氧元素，然后使其中的自由氧变成臭氧。
通过臭氧与水混合制备一定浓度的臭氧水，并在系统内循环一定时间，达到系统消毒效果，臭氧浓度与循环一定时间，达到系统消毒效果，臭氧浓度与循环时间就臭氧残留考察需要在系统验证过程中进行确认。
3、紫外线水中杀菌波长为254nm的紫外线透过水层时能杀死水中的细菌。
紫外线灭菌的特点如下：（1）紫外杀菌速度快、效率高、效果好，一般经3kW的紫外线照射10s后，对水中大肠杆菌的去除率为98%左右。
（2）紫外线照射不会改变水的物理、化学性质，对水不会带入附加物所引起的污染。
（3）能适用于各种水的流量下使用，操作简单，使用方便，只需定期地清洗石英玻璃套管即可。
（4）体积小，轻便，耗电低，寿命长。
紫外线杀菌装置由外筒、杀菌灯、石英套管及电气设施组成。
外筒由铝、镁合金或不锈钢等材质制成。
其圆管内壁要求有很高的光洁度，要求其对紫外线的反射率为85%左右。
军团菌的检测方法
军团菌的检测方法嘿，咱今天就来聊聊军团菌的检测方法。
你说这军团菌啊，就像个隐藏在暗处的小调皮，不仔细找还真发现不了它呢！要检测军团菌，首先咱得从它可能出没的地方下手。
就好比你要找一只调皮的小猫，得先去它常去的角落不是？像一些空调系统、热水系统这些地方，可都是军团菌喜欢藏的地儿。
那怎么检测呢？咱可以用培养法呀！这就好像种小花朵一样，给军团菌提供一个合适的环境，让它慢慢长出来。
把样本放在专门的培养基上，然后就等着看有没有小菌落长出来。
这要是真长出来了，那不就说明有军团菌嘛！你说这是不是很有意思？还有一种方法叫核酸检测法。
这就好像有个超级放大镜，能直接找到军团菌的基因片段。
一下子就把它给揪出来啦！多厉害呀！血清学检测也不能少哦！就好像给军团菌做个标记，看看我们身体里有没有对它产生反应。
要是有相应的抗体，那不就说明我们可能和军团菌打过交道啦？你想想啊，要是没有这些检测方法，我们怎么能知道有没有被这个小调皮给捣乱呢？那可不行呀！咱得把它给抓住，不能让它随便捣蛋。
检测军团菌可不是一件容易的事儿啊，需要我们细心再细心。
就跟找宝藏似的，得一点一点地去挖掘。
而且检测的时候还得注意好多细节呢，不然一不小心就可能让它给跑掉啦！咱得严格按照操作步骤来，不能马虎。
这可不是闹着玩的，万一没检测好，让军团菌溜走了，那可就麻烦啦！这就好像你去抓小偷，要是不认真，小偷不就跑掉了嘛！总之啊，军团菌的检测方法很重要，我们得好好掌握。
这样才能及时发现它，把它给解决掉，让我们的生活更加健康、安全。
别小瞧了这些检测方法，它们可是我们对抗军团菌的有力武器呢！所以啊，大家都要重视起来哦！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
对于军团菌属菌的消毒剂、水处理方法、浴槽水用添加剂和空调冷却
专利名称：对于军团菌属菌的消毒剂、水处理方法、浴槽水用添加剂和空调冷却塔水用添加剂
专利类型：发明专利
发明人：近藤昭宏
申请号：CN201880036768.0
申请日：20181213
公开号：CN111107747A
公开日：
20200505
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种特征在于含有铁盐作为有效成分的对于军团菌属菌的消毒剂。
作为上述铁盐，可以例示硫酸铁(II)(硫酸亚铁)等二价铁盐、硫酸铵铁(III)(硫酸铁铵)等三价铁盐。
本发明还提供处理含有军团菌属菌的水的处理方法，其特征在于，使处理对象的水含有铁盐或铁离子，以抑制或阻止上述水中所含军团菌属菌的增殖。
根据本发明，能够将存在于浴槽水、空调冷却塔水等之中的军团菌属菌以高安全性和安心感且简便地进行杀菌、消毒。
申请人：株式会社日吉
地址：日本滋贺县
国籍：JP
代理机构：北京尚诚知识产权代理有限公司
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水处理系统军团菌检测及消毒方法
摘要：军团病的爆发主要是由于空调水等人工水体感染军团菌引起，因此对于系统中军团菌的检测和消毒方法越来越受到人们的重视。
该文对军团菌的检测方法和消毒方法进行了综述。
关键词：军团菌检测方法消毒方法
中图分类号：r372 文献标识码：a 文章编号：1674-098x（2012）12（a）-0-01
军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于土壤、水体中，可通过含菌气溶胶的方式在空气中散布，当人体进行呼吸时，菌气进入体内引起感染，军团病的病死率高达22.8%[1]。
军团病临床病例中由嗜肺军团菌所引起的病例占军团病的80%[2]。
因此制定规范的检测方法与指标标准对该病的预防与控制具有重要意义，而且，杀灭自然及人工水体中的嗜肺军团菌是控制军团病发生的主要环节。
1 军团菌实验室检测方法
军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环
境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，对军团病的预防与治疗十分不利。
现有的军团菌实验室检测方法主要有以下几种。
1.1 分离培养
是诊断军团菌，尤其是诊断嗜肺军团菌（lp）最准确的方法，最适培养基为bcye培养基（即活性炭—酵母提出液琼脂）国外培养阳性率可达50%～80%，但国内还达不到这么的百分率。
培养时应用
含军团菌抗体的琼脂培养及免疫放射自显影技术或克隆杂交技术，可更好地检测和计数军团菌菌落。
steinmetz等利用军团菌特异性的单克隆抗体mab2125进行克隆印迹分析，可于2 h内在培养基上众多菌落中筛选出军团菌落。
分离培养用时比较长，操作也比较复杂，且在某些标本中还会存在着其他的物质，他们会阻止军团菌的生长，给培养带来了困难，无法观察到军团菌的完整的初期现象。
1.2 直接免疫荧光法（dfa）
这种方法也是检测军团菌最常用方法。
这种方法可以在2 h内就能得到结果，但操作复杂，敏感性低。
将单克隆抗体应用于dfa可同时提高此法的敏感性和特异性。
1.3 核酸探针技术
原位杂交技术不仅能够特异性地检测到细菌，且可完整地保持组织细胞及细菌的形态，将原位杂交和聚焦激光扫描电镜技术结合将有助于检测细菌的空间及时间分布情况[3]。
1.4 尿抗原的检测
plouffe等报道了用免疫学方法检测lp血清i型尿抗原，证明此法特异性>99.5%敏感性80%～90%。
1992年tang报道利用广谱elisa 法可同时对嗜肺及非嗜肺军团菌病患者尿抗原进行检测，敏感行高、特异性好，且有检测快速（3 h内可获结果）、标本容易获得的优点。
steinmetzs等报道可利用一种针对军团菌特异性抗原决定簇60kdahsp的单克隆抗体检测尿军团菌抗原。
到现在还没找到合适的试剂盒，但这种方法是判断早期军团病最有效，最有发展的一种实
验方法。
1.5 pcr及其相关技术的应用
近几年聚合酶链式反应（pcr）及其相关技术的发展为军团菌的检测提供了快速、敏感的方法。
pcr，可检测到每ml水中1cfu的细菌，无论标本细菌是死是活，都可以检测。
在培养中其他细菌掩盖军团菌生长和生产毒素抑制生长，pcr就不用担心以上情况的发生。
pcr法是将军团菌的特定目的基因在体外扩增上万倍，甚至几十万倍，扩增产物在含溴化已锭的琼脂糖凝胶上检测。
2 军团菌消毒方法
消毒方法的选择要根据军团菌所处的环境体条件（如ph值、温度、有机物及无机物含量和组成等）来定，适当的消毒方法才能达到理想的消毒效果。
当军团菌所在的水体中存在生物垢泥以及阿米八虫时，军团菌的除灭就比较困难，药剂的计入量和接触时间都需要成倍增加。
在实验室已发现某些藻类的提出物能刺激嗜可为军团菌的大量生长繁殖捕捉、聚集其所需的各种营养肺军团菌的生长，四膜虫可维军团菌在细胞内的生长，棘皮阿米巴的收缩性空泡，在有生物垢泥的条件下，消毒药剂的使用量要提高4倍才能达到效果。
现有对军团菌的杀菌方法主要分两类：化学方法和加热法。
2.1 化学方法
主要是采用金属离子，如铜-银离子，氧化剂如卤素及其化合物包括氯、溴、碘，二氧化氯、氯胺盐和卤化乙内酰脲等，臭氧，和过氧化氢，非氧化剂包括杂环酮类，胍类，硫代氨基甲酸酯类等和
紫外光。
lin等研究了分别使用铜、银离子和公共使用铜银离子的杀菌效果，二者对军团菌都有较好的杀灭效果，但同时使用会有协同效应，杀菌效果更好。
目前，使用最多的是含氯制剂。
含氯制剂具有以下三个特色：（1）长效性；（2）腐蚀性；（3）产生消毒副产物。
有关文献报道，要达到持续抑制军团菌的效果，氯的浓度要在2～6 mg/l，这比传统的处理饮用水的氯浓度（≤1 mg/l）高很多，相应的消毒副产物的量也就增多，而且由于使用含氯制剂易腐管道，空调系统过多使用含氯试剂可能会降低空调使用寿命。
因此使用含氯制剂不是最理想的。
许多有机药剂被用于军团菌的消毒，使用最广泛的是杂环酮类，以异噻唑啉酮类为代表。
但总的说来，非氧化剂效果不如氧化剂杀菌效果好。
嗜肺军团菌比其他革兰氏阴性菌对紫外线敏感，所以采用紫外线处理水中的嗜肺军团菌是可行的。
但用于紫外线无“余氯”效果，无法有效控制军团菌的再生，因此他的使用也受到了限制。
另外，电化学方法也被用来杀灭军团菌。
chuanping feng 等用
ti/ruo2作阳极涂层对冷却塔水进行电解，发现能有效控制军团菌。
但是电解消毒，其效果受ph值及水硬度的影响。
ph值高或水硬度高其杀菌效果就不好，而空调冷却塔水的ph值及水硬度都比较高。
2.2 加热消毒法
此法广泛用于锅炉循环水系统的军团菌消毒。
有关文献报道，当水温增高到42 ℃时，大肠杆菌等受到抑制，而军团菌仍能存活。
水温65 ℃需要25 min才能完全杀死军团菌。
水温70 ℃可在10 min
内杀死该菌。
3 结语
直到现在，还没有一种防范措施可以有效控制水环境中的军团菌，而衡定的去除或控制人工水环境中的藻类、有机物和阿米巴等可能是控制军团菌的关键步骤。
参考文献
[1] 俞树荣.微生物学和微生物学检验[m].2版. 北京；人民卫生出版.
[2] 谢哲子.军团菌家族及其致病性[j].国外医学外生物学分册，1996，19（5）；23-25.
[3] 金建敏.军团菌研究进展[j].国外医学内科学分册，2001，28（10）.。