水中军团菌检测(ISO11731-1998)
水处理系统军团菌检测及消毒方法
水处理系统军团菌检测及消毒方法作者：范春红来源：《科技创新导报》2012年第34期摘要：军团病的爆发主要是由于空调水等人工水体感染军团菌引起，因此对于系统中军团菌的检测和消毒方法越来越受到人们的重视。
该文对军团菌的检测方法和消毒方法进行了综述。
关键词：军团菌检测方法消毒方法中图分类号：R372 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（a）-0-01军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于土壤、水体中，可通过含菌气溶胶的方式在空气中散布，当人体进行呼吸时，菌气进入体内引起感染，军团病的病死率高达22.8%[1]。
军团病临床病例中由嗜肺军团菌所引起的病例占军团病的80%[2]。
因此制定规范的检测方法与指标标准对该病的预防与控制具有重要意义，而且，杀灭自然及人工水体中的嗜肺军团菌是控制军团病发生的主要环节。
1 军团菌实验室检测方法军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，对军团病的预防与治疗十分不利。
现有的军团菌实验室检测方法主要有以下几种。
1.1 分离培养是诊断军团菌，尤其是诊断嗜肺军团菌（LP）最准确的方法，最适培养基为BCYE培养基（即活性炭—酵母提出液琼脂）国外培养阳性率可达50%～80%，但国内还达不到这么的百分率。
培养时应用含军团菌抗体的琼脂培养及免疫放射自显影技术或克隆杂交技术，可更好地检测和计数军团菌菌落。
Steinmetz等利用军团菌特异性的单克隆抗体MAb2125进行克隆印迹分析，可于2 h内在培养基上众多菌落中筛选出军团菌落。
分离培养用时比较长，操作也比较复杂，且在某些标本中还会存在着其他的物质，他们会阻止军团菌的生长，给培养带来了困难，无法观察到军团菌的完整的初期现象。
1.2 直接免疫荧光法（DFA）这种方法也是检测军团菌最常用方法。
这种方法可以在2 h内就能得到结果，但操作复杂，敏感性低。
将单克隆抗体应用于DFA可同时提高此法的敏感性和特异性。
新的水系统军团菌方案____PALINTEST建议
新的水系统
军团菌无检出
连续三个月附 合标准
不稳定系统 存在安全隐患
军团菌阳性检出
连续六个月附 合标准
安全系统 安全隐患较小
存在超标
高危系统 需应急处理
军团菌阳性检出
理想系统
存在超标
军团菌阳性检出
军团菌 细菌总数 氧化性杀菌剂 一般清洗
每季度一次（不检出） 每周一次 （<10,000/mL 并 小于前一次测量值的10倍） 每周一次（Cl > 0.5ppm或 Br > 1ppm） 每季度一次（硬件设施、自 动化设备状态良好，加药泵 计量精确运转正常。 每年2次，包括更换冷却塔 罩。在清洗消毒前需从塔罩 上刮取样品，检测军团菌 （不得检出） 每月一次（不检出） 每周一次 （<10,000/mL ) 每周一次（Cl > 0.5ppm或 Br > 1ppm） 每周一次（不检出）
冲击投药应急处理：
每周一次（如 > 100,000/mL 立即采购应急处理措施 每周一次（Cl > 0.5ppm或 Br > 1ppm）
将余氯维持在50ppm消毒1 小时或 将余氯维持在5ppm 消毒24. 在24小时和1周后测量军团 菌是否为阴性
每季度一次（硬件设施、自 动化设备状态良好，加药泵 计量精确运转正常。
每年2次，消毒后从塔罩上刮 取样品，检测军团菌（不得 检出）
每季度一次（硬件设施、自 动化设备状态 消毒前后应采用同一种军团菌检测 方法。
军团菌评估
军团菌评估军团菌（Legionella）是一类革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然环境中，尤其是水体中。
它们可以引发严重的呼吸道感染，其中最为严重的是军团病（Legionnaires' disease）。
为了评估军团菌的风险和采取相应的控制措施，军团菌评估成为了重要的研究领域。
军团菌评估的目的是确定军团菌在特定环境中的存在和扩散情况，以及评估其对人体健康的潜在风险。
评估的过程包括采样、分析和解释结果。
首先，需要选择合适的采样点，通常是与水有直接接触的设备或系统，如水龙头、喷淋器、冷却塔等。
采样时应注意避免污染，并确保采样方法的准确性和可重复性。
采样后，需要对样品进行分析，以检测军团菌的存在和浓度。
常用的分析方法包括培养法、PCR法和免疫学方法。
培养法是最常用的方法，但需要较长的时间来获取结果。
PCR法可以快速检测军团菌的DNA，但对实验条件和技术要求较高。
免疫学方法则通过检测军团菌的抗原或抗体来进行分析。
解释评估结果时，需要考虑军团菌的浓度、种类和环境因素等。
根据相关的指南和标准，可以确定军团菌的风险等级，并采取相应的控制措施。
例如，在公共场所或医疗机构中，如果军团菌的浓度超过了安全标准，就需要采取消毒、清洗或更换设备的措施，以减少感染的风险。
军团菌评估还需要考虑环境因素对军团菌生长和传播的影响。
温度、湿度、水质和水流等因素都可能影响军团菌的繁殖和存活。
因此，在评估过程中，需要对环境因素进行监测和控制，以减少军团菌的生长和传播。
除了评估军团菌的风险，预防和控制也是至关重要的。
定期清洗和消毒水系统、保持水质和流动性、加强设备维护等措施可以有效地减少军团菌的滋生和传播。
此外，加强公众教育和意识提高也是预防军团病的重要手段，人们应该了解军团菌的传播途径和预防措施，以保护自己的健康。
军团菌评估是评估军团菌在特定环境中存在和扩散情况的过程。
通过采样、分析和解释结果，可以确定军团菌的风险等级，并采取相应的控制措施。
军团菌培养基基础产品说明书
广东环凯微生物科技有限公司网址： 地址：广州市黄埔区科学城神舟路788号邮编：510663传真：860288778876产品说明书Product Manual【产品名称】通用名称：军团菌培养基基础英文名称：Legionella Medium Base【产品编号与包装规格】产品编号产品类型包装规格026071干粉250g/瓶【产品用途】用于嗜肺军团菌的分离培养。
【检验原理】酵母浸膏提供军团菌生长必需的营养物质；活性炭分解过氧化氢，收集二氧化碳，改善表面张力；琼脂是培养基的凝固剂。
【使用方法】1、配制BCYE 琼脂：称取本品干粉2.5g，加入蒸馏水或去离子水90mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，于121℃灭菌15min。
待培养基冷却至50℃左右时，加入2支BCYE 生长添加剂（SR0600），混匀，制成平板培养，待用。
2、配制BCYE-Cys 琼脂：称取本品干粉2.5g，加入蒸馏水或去离子水90mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，于121℃灭菌15min。
待培养基冷却至50℃左右时，加入2支BCYE-Cys 生长添加剂（SR0610），混匀，制成平板培养，待用。
3、配制GVPC 琼脂：称取本品干粉2.5g，加入蒸馏水或去离子水85mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，于121℃灭菌15min。
待培养基冷却至50℃左右时，加入2支GVPC 生长添加剂（SR0560A）和1支GVPC 选择性添加剂（SR0560B），混匀，制成平板培养，待用。
【质量控制】下列质控菌株接种后于35～37℃培养18～24h ，观察结果如下表：、BCYE 琼脂生物学指标下列菌株接种BCYE 琼脂后于36±1℃培养3-10天生长情况如下表：BCYE-Cys 琼脂生物学指标下列菌株接种BCYE-Cys 琼脂后于36±1℃培养3—10天生长情况如下表：GVPC 琼脂生物学指标下列菌株接种GVPC 琼脂后于36±1℃培养3—10天生长情况如下表：广东环凯微生物科技有限公司网址： 地址：广州市黄埔区科学城神舟路788号邮编：510663传真：************-8619************8602************88778876干粉培养基：贮存于避光、干燥处，用后立即旋紧瓶盖；贮存期三年。
军团菌检测
军团菌检测方法一、军团菌简介军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。
军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。
即与水有关的地方均可能存在军团菌。
军团菌传播、感染有以下特点：1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50％病例在夏季发生。
2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。
3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。
军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。
生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2％－5％CO2能促进部分菌株的生长。
军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。
军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。
菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。
军团菌属有41个种，61个血清型。
侵肺军团菌（Legionella pneumophila, LP）有15个血清型，是引起军团菌病的主要菌型（占80%以上）。
军团菌病是一种急性呼吸道传染病，临床类型目前至少有肺炎型与庞蒂阿克热型。
本病主要为呼吸道飞沫(气溶胶)传播。
目前尚无证据表明感染者、病人或感染动物作为本病的传染源，通常把传染本菌的水源(天然水、人工管道水源、冷却塔、冷热管道系统水等)作为传染源。
二、军团菌的检测方法——ISO11731:19981．范围本标准描述了一种用于军团菌分离和估计环境样品中军团菌数量的培养方法。
该方法适用于所有环境样本，包括饮用水、工业用水和天然水以及沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关样本。
2．培养基和试剂2.1 BCYE培养基(也可用硝酸铁琼脂代替)2.2 BCYE-Cys(不含L-半胱氨酸)2.3 GVPC培养基2.4酸处理缓冲液3．取样3.1取样容器水样可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。
淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录
淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录管理编号：xxx/XX-XXX报告编号：第页/ 共页检测项目淋浴水中嗜肺军团菌送检日期检毕日期检测环境温度：ºС 相对湿度：% 检测地点样品来源样品编号仪器型号及编号检测方法或依据参照GB/T 18204.5-2013 《公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统》和ISO11731-1998《水中军团菌检测方法》一、试验器材及试剂1、细菌培养皿2、BCYE培养基3、BCYE-CYS培养基4 、选择性培养基：GVPC培养基5、酸缓冲液6、灭菌水二、样品前处理1、采样：用高压灭菌的玻璃瓶取水样0.5L。
2 、送样：将样品避光避热一天内送达实验室，从采样到培养的时间间隔最大不超过15天。
三、检验步骤1、样品预处理水样：将水样mL用0.22μm微孔滤膜过滤，用镊子将滤膜转移到具帽容器中，加入15mL 灭菌水，在震荡器上震荡，时间不少于2min。
肉眼可见浑浊的污水水样可直接培养。
将预处理过的样品分成三部分，一部分不作处理，一部分热处理，一部分酸处理。
热处理：将1mL样品加入到无菌容器中50℃水浴处理30分钟。
酸处理：取1mL样品加入到无菌容器中，加入1 mL酸缓冲液，作用5min。
检测人：校核人：淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录管理编号：xxx/XX-XXX报告编号：第页 / 共页2、接种各取0.1mL三种样品（未处理、热处理、酸处理）接种到GVPC培养基上，用无菌接种环将接种物均匀地涂抹于培养基表面。
热处理、酸处理的接种物处理过后立即进行接种。
3、培养待接种物水分被培养基吸收后，倒置培养基平皿，于5% CO2培养箱中37℃培养10天。
注意保持培养箱内湿度。
每隔三天观察培养的菌落的形态。
记下各种形态菌落的数目。
四、结果判定1、军团菌的鉴定从GVPC培养基上选择至少三个具有军团菌特征的菌落（未处理、热处理、酸处理的三种样品每个样品取三个菌落），接种于BCYE培养基和BCYE-CYS 培养基上，37℃培养2天以上。
一起由沐浴水中军团菌引起的感染事件的水质实验室检测
•实验室管理•一起由沐浴水中军团菌引起的感染事件的水质实验室检测宋晖乔玫王2019年7月1日，我省某市4所医院陆续接诊数10例发热患者，截止2019年7月4日17时，共接诊发病患者88例，住院58例，留观14例，治疗后离院16例，所有患者病情稳定，无危重患者。
所有患者均有6月28日至6月30日至某。
中心，营业时日早9.00至晚24:00点，女浴室总面积约600m2,内设有2个约20m2的浴池；男浴池总面积约1000m2,内设有2个约8m2的浴池，1个约30m2发，女浴6月29日发251,6月30日发136浴室管理：6月29至30日在女9 ,3,均发病省市区疾控中心，本次危险暴露因素为女病原E M病，患者-室测疾病发某中心测1材料与方法1.1材料1.1.1培养基：血营养琼脂培养基，军团菌生长培养基（BCYE）,用E GVPC）。
1.1.2：均用1.1.3:诊抗血清试剂（科玛嘉诊断血清试剂盒），1.2方法1.2.1品来源：由我省某市疾病控制中心人员采集送检。
无菌广口瓶沐标26份（500mL/瓶）。
1.2.2检测方法:依据GB/T18204.5-2013,《公共场所卫生检验方法第5部分：中空调通风系统》3;WS394-2012，《公共所中空通风系统卫生规范》附B中的方法进；计数米用Legiolert方法。
1.2.3测步骤：①品离心（过滤）一15mL灭菌水洗脱2mL脱样品热处理!2mL脱样品酸处理。
②接种与培养:取脱品0.2mL、热处理品及酸处理样品各0.1mL，分别接种GVPC平板接种平板静置于C02箱中,35"，孵育10d。
挑取可疑菌落接种BCYE琼脂,35"培2d。
③型确定:进化与清确定嗜肺军D0I：10.19522/ki.l671-5098.2020.03.051作者单位:030012太原，山西省疾病预防控制中心消毒监测科（宋晖、乔玫、王静），质量管理科（武S）,办公室（马麟）静武（马麟团菌.2结果对26份沐浴水，进行军团菌分离培养和浓度计数，结果中东出嗜肺浓度2.2cfu/mL,中西出嗜肺浓度3.5cfu/mL，女东出嗜肺团菌浓度＞2272.6cfu/mL,女西浴池检出嗜肺军团菌浓度939.8cfu/mL，女浴砂箱水（东）检出嗜肺军团菌浓度＞2272.6 cfu/mL,女浴砂箱水（西）检出嗜肺军团菌浓度872.3cfu/mL,绢水素风吕设备水检出嗜肺军团菌浓度＞2272.6cfu/mL,东女砂箱出嗜肺浓度1922.6cfu/mL,西女浴砂箱水检出嗜肺军团菌浓度735cfu/mL，检出率34.61%。
水中军团菌检测(ISO11731-1998)
1.适用范围本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂2.1 GVPC：2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.2.5血平板(BA)2.6革兰氏染色液2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
军团菌控制指标及水处理系统中的预防措施
军团菌控制指标及水处理系统中的预防措施军团菌最早是在1976年“费城军团病事件”中首次被科学家发现，它们大量生长在30～40℃、营养充足的水体中，循环冷却水、冷却塔系统以及夏秋季节的喷泉系统成为最易滋生军团菌的场所。
军团菌往往随着这些系统中水的蒸发，附着在气溶胶表面，散播到空气中。
免疫力低下的人群，一旦吸入了被军团菌污染的空气，就可能患上一种症状类似肺炎的疾病，称作军团病。
因此,对于经常出入宾馆、大型写字楼等有中央空调的场所以及经常接触循环冷却水、喷泉系统的人来说，军团菌具有很大的潜在危害。
目前，美国、日本以及欧洲一些发达国家对军团菌的控制均有一定的规范，因此，我们综合介绍上述国家的规定，希望对我国立法有一定帮助。
并且，针对军团菌易滋生的冷却塔、冷热水管道系统、喷泉系统等场所提出了相应的预防措施。
1军团菌的控制指标为了控制军团菌传播，欧洲一些国家于1986年专门成立了一个组织——The European Working Group for Legionella Infections（EWGLI）。
在这个组织的官方网站（）上，刊列了十分详尽的关于防止和控制军团病传播的指导准则（The European Guidelines for Control and Prevention of Travel Associated Legionnaires’ Disease）［1］，其中包括了当军团病爆发时应该采取的措施，同时为宾馆或其他相关建筑的水系统维护人员提供了全面防治军团菌的技术方法和标准（表1）。
在亚洲，新加坡环境部环境流行病学会和世界卫生组织环境流行病学合作中心，最早于1992年8月为新加坡制订了第一个有关军团菌控制的法规——Code of Practice for the Control of Legionella Bacteria in Cooling Towers，以后经过多次修订。
这部法规为冷却塔系统中军团菌的控制制订了详细的方法、应急措施以及各类标准［2］（表2）。
关于军团菌
军团菌的历史一、1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病,经研究,发现一种细菌命名为嗜肺军团菌.随后,许多有关细菌暂被列入这一属,且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例.现已提出了超过30种军团杆菌,至少19种是人类肺炎的病原.其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似,具有共同的生化特征,引起类似疾病.二、疾病的范围包括：(1)无症状血清变化；(2)自限性无肺炎的流感样病态,有时叫做庞提阿克热(Pontiac fever)；(3)军团人员病为最严重和最常见到的肺炎类型；(4)局限性,罕见的软组织感染.三、军团病占需住院治疗的社区获得性肺炎的1%~8%,占致死性医院内获得性肺炎的4%左右.大多数病例为散发性,多发生于夏末和秋初.人和人之间的传播尚未得到证实.当给水系统受到污染或形成气溶胶的病原体经空调系统冷凝器的蒸发气体,或污染的淋浴喷头传播时,嗜肺军团菌则暴发流行.军团病可发生于任何年龄,但大多数人都是中年男性.已确定的危险因素包括吸烟,滥用酒精和免疫抑制,特别是由皮质类固醇引起的免疫抑制.四、军团菌是隐藏在空调制冷装置中的致病菌，随冷风吹出浮游在空气中，吸入人体后会出现上呼吸道感染及发热的症状，严重者可导致呼吸衰竭和肾衰竭。
军团菌最早是由于部队室内密闭作业，导致群体发生上呼吸道感染而得名。
军团病是一种非常严重的、有时可以致命的肺炎。
军团病是由军团杆菌引起，这种细菌产生在自然环境中，在温水里及潮热的地方蔓延。
人工供水系统有时也能为军团杆菌的大量繁殖提供生存环境。
这些系统包括淋浴器、矿泉池、喷泉以及空调设备的冷却水塔。
人们通常是由于呼吸了被军团杆菌污染的水源散发的水雾而传染上军团病的。
据估计，在美国每年都有国每年都有8000~18000人感染上军团病。
军团菌的分离培养与鉴定
军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型 （serogroups)，至少有20个种可引起人感染。
军团菌种
种名 Legionella pneumophila
发现时间
1979
种名 Legionella maceachernii
发现时间
1985
种名 Legionella geestiana
1980
1980 1980 1980 1980 1982 1982 1983
Legionella parisiensis
Legionella rubrilucens Legionella santicrucis Legionella spiritensis Legionella steigerwaltii Legionella israelensis Legionella birminghamensis Legionella brunensis Legionella cincinnatiensis Legionella moravica Legionella quinlivanii
水样的正压膜过滤法
1. 安放滤膜；
2. 过滤；
3. 取膜；
4. 洗膜。
水样的离心
1. 将200ml左右样品倒入容积为300～500ml的无菌离心瓶 中； 2. 6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在 15～25℃之间； 3. 无菌操作去除上清； 4. 用5～20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。
军团菌操作生物安全性
应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。
《可感染人类的高致病性病原微生物菌 （毒）种或样本运输管理规定》
集中式中央空调冷却塔水军团菌污染状况及菌型分析
中国卫生检验杂志 2009年 1 月 第 19卷 第 1期
C h inese Jou rnal of H ea lth Laboratory Technology, Jan 2009 ; V ol 19 N o 却塔水军团菌污染状况及菌型分析
蒋兴祥, 沈红, 赵霞 贇, 何婷婷 , 蒋卓婧
Ch inese Journal ofH ealth Laboratory T echnology, Jan 2009; V ol 19 N o 1
2 2 军团菌的菌型分布情况 74 份冷却塔水中检出 90 株军团菌 , 其菌型 分布为 LP1 型 占 64 44% ( 58 /90 ) 、LP6 型 占 5 56 % ( 5 /90 ) 、LP8 型 占 11 11% ( 8 /90) 、LP9 型 占 4 44 % ( 4 /90) 、LP10 型占 14 44% ( 13 /90) 。 从 型 别 鉴 定 可 知 , 以 LP 1 型 为 主 , 占 总 检 出 数 64 44% ( 58 /90) 。同一水样 检出 2 株及 以上菌型 有 13 份 , 占 阳性水样的 17 57 % ( 13 /74), 其 中同份 水样检 出 2 株菌 型 10 份、 检出 3 株菌型 3 份 , 结果见表 2 。
1株非嗜肺军团菌的鉴定
[Key words] Legiongella; Non-pneumophila Legionella; Molecular diagnosis
军团菌病是由军团菌感染引起的一种急性细 菌性呼吸道传染病，该病传播途径是经呼吸道，以 气溶胶的形式传播。 随着城市经济的快速发展，大 型建筑物的兴建及随之而来中央空调系统、 冷却 塔、淋浴设施等现代化设备的广泛使用，人们的暴 露机会也会随着增多， 军团菌病流行和暴发的危 险性也日益增加， 目前该病已成为世界各国及我 国普遍关注的公共卫生问题[1]。 由军团菌引起的疾 病有军团菌肺炎、庞蒂亚克 热(Pontiac fever)等 ，大 部分由嗜肺军团菌引起， 但非嗜肺军团菌也能引 起人类疾病[2]。 我省 2012 年 7 月从一份中央空调 冷却塔水中分离出 1 株疑似非嗜肺军团菌并进行 了鉴定分析，现将结果报告如下。 １ 材料与方法 1.1 试 剂 GVPC 平 板 、BCYE-α 平 板 、BCYE-cys 平板及血平板购自广州环凯微生物科技有限公 司，在有效期内使用。 生化反应管购自北京友康有
军团菌 水质 标准
军团菌水质标准
军团菌是一种存在于自然界中的微生物，水是它的自然栖息地。
军团菌在环境中的生存和扩散必须具备以下条件：相对静止的水环境、合适的温度（20℃~40℃）、合适的酸碱度（pH值5-8.5）、在环境内有适合寄生的微生物（阿米巴、纤毛原虫等）。
至于水质标准，目前无法提供关于军团菌在水质方面的具体标准，因为军团菌的分布和浓度会因时间、地点和环境条件的变化而有所不同。
但是，在公共场所、医院、家庭等地方，为了保障公众的健康和安全，需要对水质进行定期检测和消毒处理，以防止军团菌和其他微生物的滋生和传播。
需要注意的是，在军团菌的检测方面，需要采用专业的检测方法和仪器，同时需要遵守相关的卫生标准和操作规程，以确保检测结果的准确性和可靠性。
世界卫生组织(who)饮用水水质标准
（二）有机组份
（P）—临时性指标值，该项目适用于某些组分，对这些组分而言，有一些证据说明
这些组分具有潜在的毒害作用，但对健康影响的资料有限；或在确定日容许摄入量（TDI）时不确定因素超过1000以上。
**对于被认为有致癌性的物质，该指导值为致癌危险率为10-5时其在饮用水中的
浓度（即每100，000人中，连续70年饮用含浓度为该指导值的该物质的饮用水，
有一人致癌）。
&NAD—没有足够的资料用于确定推荐的健康指导值。
#ATO—该物质的浓度为健康指导值或低于该值时，可能会影响水的感官、嗅或味。
C饮用水中常见的对健康影响不大的化学物质的浓度
U—对于这些组分不必要提出一个健康基准指标值，因为它们在饮用水中常见的浓度下对
人体健康无毒害作用。
a.这里所指的水准值不是精确数值。
根据当地情况，低于或高于该值都可能出现问题，
故对有机物组分列出了味道和气味的上下限范围。
b.TCU，色度单位。
c.NTU，散色浊度单位。
冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法
冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法本附录规定了集中空调通风系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中嗜肺军团菌的检验方法。
A1原理待测水样经过滤膜或离心浓缩后，一部分样品经酸处理与热处理，以减少杂菌生长，一部分样品不作处理。
将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养，生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。
A2 主要仪器设备A2.1 平皿：90mmA2.2 培养箱：35~37℃A2.3 紫外灯：波长360±2nmA2.4 滤膜滤器A2.5 滤膜：孔径0.22～0.45µmA2.6 蠕动泵A2.7 离心机A2.8 涡旋振荡器A2.9 普通光学显微镜、荧光显微镜、体式镜A2.10 水浴箱A3 采样A3.1 采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉积物与软泥需用广口瓶，容器均需螺口或磨口，用前灭菌。
A3.2 采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约200ml。
A3.3 中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。
A3.4 样品运输与贮存：样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。
A4 方法与步骤A4.1 样品处理A4.1.1 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。
A4.1.2 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22～0.45µm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。
A4.1.3 热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。
A4.1.4 酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。
A4.2 接种与培养：取A4.1.2洗脱样品、A4.1.3 热处理样品及A4.1.4 酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板。
将接种平板静置于CO2培养箱中，温度为35~37℃，CO2浓度为2.5%。
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1.适用范围
本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂
2.1 GVPC：
2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid
(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将
SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：
2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将
SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：
2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将
SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：
A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39ml
B液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250ml
A, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.
2.5血平板(BA)
2.6革兰氏染色液
2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
3.设备及容器
3.1 ø90mm无菌培养皿。
3.2 培养箱：36±1ºC。
3.3 紫外灯360±20nm
3.4 Millipore过滤装置、真空泵及漏斗。
3.5 无菌过滤膜：直径47mm，孔径为0.45μm。
3.6 pH计：精度±0.1。
3.7 高压灭菌锅：121℃/15min；121℃/20min。
3.8 水浴锅：50±1℃
3.9 涡旋振荡器。
3.10离心机及离心管。
3.11三角烧瓶或培养基瓶：用于培养基的灭菌和贮藏。
3.12光学显微镜。
3.13接种环：ø3mm，镍铬丝。
3.14无菌涂抹棒。
4.检测程序
4.1 如果液体样品中军团菌数量每升大于105个，可以采用平板直接涂布法。
如果低于此数
量或数量未知，需要采用膜过滤法进行富集（4.2.1）。
对于沉淀物或污泥等，采用直接稀释和培养。
4.2 样品前处理
4.2.1 水样的膜过滤法富集
无菌的将过滤膜及漏斗放置于灭菌过的过滤装置上，过滤抽取200mL水样，将过滤好的膜用无菌镊子从过滤装置上取下，放于20mL的无菌蒸馏水中，剧烈震荡
2min。
4.2.2 沉淀物和污泥等
根据含菌量，用无菌蒸馏水对样品进行稀释，涡旋振荡2min，振荡前可加入一层（厚度大约1cm）无菌玻璃珠以帮助分解样品。
4.3 热处理和酸处理
将富集过的或未富集过的样品分为3部分，一部分不再经过任何处理，一部分要经过热处理，一部分要经过酸处理。
4.3.1 热处理
取1mL样品（富集或未富集）到无菌试管中，将其放于50±1℃的水浴中加热30±2min。
4.3.2 酸处理
取5mL样品（富集或未富集）到无菌试管中，再加入5mL酸处理液，涡旋振荡混匀后，静置5min。
4.4 接种
取0.1mL未处理样品（富集或未富集）用无菌涂布棒涂布于GVPC平板上。
取0.1mL热处理样品（富集或未富集）用无菌涂布棒涂布于第二块GVPC平板上。
取0.1mL酸处理样品（富集或未富集）用无菌涂布棒涂布于第三块GVPC平板上。
4.5 培养及菌落观察
接种液被完全吸收后，倒置平板放于36±1℃培养10天。
为保持培养箱中的湿度，可在培养箱底部放置一盘水。
军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，可以每隔2-4天观察一次。
记录每种菌落形态的数量。
军团菌的典型菌落形态：多呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、粉红色、灰绿色或深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，有荧光。
4.6 确证实验
对三块GVPC上的每种类型的典型菌落进行计数。
从每个GVPC平板上挑取每种类型的2-3个典型菌落，划线于BCYE和BCYE-Cys平板（或血平板），倒置平板放于
36±1℃培养3天。
如果BCYE平板上生长并且BCYE-Cys平板（或血平板）上不生长，可确认为军团菌。
采用军团菌乳胶凝集试剂盒可对军团菌的种类进行进一步分型。
4.7 结果的表达
4.7.1 定性：对富集过的样品，可以报告检出或未检出/200mL。
4.7.2 定量：从三个GVPC平板上挑取已确认的含有最多数量的军团菌落数来计算样品所含
的军团菌数量。
军团菌数(cfu/mL)= 确认的军团菌数/挑取的菌落数*菌落总数*稀释度/样品量。
5.参考文献
5.1 ISO 11731：1998 Water quality-Detection and enumeration of Legionella.。