水中军团菌检测(ISO11731-1998)

1.适用范围
本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。

2.培养基与试剂
2.1 GVPC：
2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。

2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid
(SR0152E)。

2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将
SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。

2.2 BCYE：
2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。

2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。

2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将
SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。

2.3 BCYE-Cys：
2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。

2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。

2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将
SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。

2.4 酸缓冲液配制：
A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39ml
B液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250ml
A, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.
2.5血平板(BA)
2.6革兰氏染色液
2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。

3.设备及容器
3.1 ø90mm无菌培养皿。

3.2 培养箱：36±1ºC。

3.3 紫外灯360±20nm
3.4 Millipore过滤装置、真空泵及漏斗。

3.5 无菌过滤膜：直径47mm，孔径为0.45μm。

3.6 pH计：精度±0.1。

3.7 高压灭菌锅：121℃/15min；121℃/20min。

3.8 水浴锅：50±1℃
3.9 涡旋振荡器。

3.10离心机及离心管。

3.11三角烧瓶或培养基瓶：用于培养基的灭菌和贮藏。

3.12光学显微镜。

3.13接种环：ø3mm，镍铬丝。

3.14无菌涂抹棒。

4.检测程序
4.1 如果液体样品中军团菌数量每升大于105个，可以采用平板直接涂布法。

如果低于此数
量或数量未知，需要采用膜过滤法进行富集（4.2.1）。

对于沉淀物或污泥等，采用直接稀释和培养。

4.2 样品前处理
4.2.1 水样的膜过滤法富集
无菌的将过滤膜及漏斗放置于灭菌过的过滤装置上，过滤抽取200mL水样，将过滤好的膜用无菌镊子从过滤装置上取下，放于20mL的无菌蒸馏水中，剧烈震荡
2min。

4.2.2 沉淀物和污泥等
根据含菌量，用无菌蒸馏水对样品进行稀释，涡旋振荡2min，振荡前可加入一层（厚度大约1cm）无菌玻璃珠以帮助分解样品。

4.3 热处理和酸处理
将富集过的或未富集过的样品分为3部分，一部分不再经过任何处理，一部分要经过热处理，一部分要经过酸处理。

4.3.1 热处理
取1mL样品（富集或未富集）到无菌试管中，将其放于50±1℃的水浴中加热30±2min。

4.3.2 酸处理
取5mL样品（富集或未富集）到无菌试管中，再加入5mL酸处理液，涡旋振荡混匀后，静置5min。

4.4 接种
取0.1mL未处理样品（富集或未富集）用无菌涂布棒涂布于GVPC平板上。

取0.1mL热处理样品（富集或未富集）用无菌涂布棒涂布于第二块GVPC平板上。

取0.1mL酸处理样品（富集或未富集）用无菌涂布棒涂布于第三块GVPC平板上。

4.5 培养及菌落观察
接种液被完全吸收后，倒置平板放于36±1℃培养10天。

为保持培养箱中的湿度，可在培养箱底部放置一盘水。

军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，可以每隔2-4天观察一次。

记录每种菌落形态的数量。

军团菌的典型菌落形态：多呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、粉红色、灰绿色或深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，有荧光。

4.6 确证实验
对三块GVPC上的每种类型的典型菌落进行计数。

从每个GVPC平板上挑取每种类型的2-3个典型菌落，划线于BCYE和BCYE-Cys平板（或血平板），倒置平板放于
36±1℃培养3天。

如果BCYE平板上生长并且BCYE-Cys平板（或血平板）上不生长，可确认为军团菌。

采用军团菌乳胶凝集试剂盒可对军团菌的种类进行进一步分型。

4.7 结果的表达
4.7.1 定性：对富集过的样品，可以报告检出或未检出/200mL。

4.7.2 定量：从三个GVPC平板上挑取已确认的含有最多数量的军团菌落数来计算样品所含
的军团菌数量。

军团菌数(cfu/mL)= 确认的军团菌数/挑取的菌落数*菌落总数*稀释度/样品量。

5.参考文献
5.1 ISO 11731：1998 Water quality-Detection and enumeration of Legionella.。