军团菌

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V- ++++++ -
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注：“+”表示反应结果为阳性，“V”表示重复实验的结果不一致
c． 实验中用到的用户自定义数据库，是根据少量标准菌株（20 株）的实验数据建立的，但 已经能够鉴定军团菌的分离菌株，并得到和血清实验一致的结果。如果能对所有已知军 团菌（包括标准菌株和尽可能多的实验菌株）进行检测，积累数据，将能得到更稳定、 更准确的数据库。
NCTC 12180 嗜肺军团菌血清型 12 型 NCTC 12181 嗜肺军团菌血清型 13 型
NCTC 12174 嗜肺军团菌血清型 14 型 NCTC 11987 红光军团菌
3） 对分离菌株进行检测 利用新生成的用户自定义军团菌数据库，和 BIOLOG 原有的数据库共同对环境中新分
离的菌株进行鉴定，结果与血清型鉴定结果符合。
ELISA 法等。但检测的灵敏度不够，也有出现交叉反应而导致假阳性结果的产生。 抗体检测的另一局限性是无法对新出现的血清型进行鉴定，需要制作新的抗体血清。
4、传统生化反应 通过菌落形态、染色特征和某些生化反应，可以将军团菌鉴定到属的水平。但是大部分
传统的生化实验对军团菌都是惰性的。
三、 利用碳源反应对军团菌进行鉴定 近几年，随着代谢指纹技术的发展和应用，有研究机构开始利用美国 BIOLOG 公司的
军团菌种类 博杜菲哈以长麦嗜红 氏氏氏氏色滩氏肺光 GN2板条中的反应底物 军 军 军 军 列 军 军 军 军 团团团团军团团团团 菌菌菌菌团菌菌菌菌
菌
Tween 40 Tween 80 Methylpyruvate Monomethyl succinate Acetate ß-Hydroxybutyrate
培养基：根据军团菌的特点，对实验条件进行了改动，以 Buffered Charcoal-Yeast Extract (BCYE)为培养基。在接种 GN2 板条前，使用不含 L-半胱氨酸的 BCYE 培养基与含有 L-半 胱氨酸的 BCYE 培养基进行对照实验，确认细菌的纯度。接种前的培养时间为 72 小时。
该菌存在于水和土壤中，常经供水系统、 溶洞和雾化吸入而引起肺炎型和非肺炎型感 染。肺炎型（重症）主要由嗜肺军团菌（LP），特别是 LP1、LP6 血清型及米克戴德军团菌 引起，潜伏期 2～10 天，除呼吸道症状外还有明显的多器官损害，头痛、畏寒、发热、伴消 化道及神经系统症状及体征，致死率高。
非肺炎型（庞蒂亚克热）潜伏期短，症 状 轻，以乏力 、肌痛、发 热、干咳常见，发病 率高，但无死亡。CDC 报道该菌引起的医院感染可高达 23％，中老年人有慢性心、肺、肾 病变、糖尿病、 血液病、 恶性肿瘤、 艾滋病或接受免疫抑制剂者易发本病，且死亡率高达 45％，并易合并其他微生物感染，形成难治性肺炎。
BIOLOG 鉴定系统的另一个重要特点是具有用户自定义数据库，通过实验数据的积累， 实现数据库的无限延伸，对新发现的或系统中没有的细菌进行鉴定。
2、 BIOLOG 系统的操作方法 BIOLOG 系统由软件系统、板条和读数仪三部分组成
1） 试剂板条：根据不同的细菌种类，BIOLOG 系统包括 GN（革兰阴性需氧菌）、GP（革 兰阳性需氧菌）、AN（厌氧菌）、YT（真菌）、FF（丝状真菌）等五种鉴定板条 2） 菌液的配置：按要求配置一定浓度的菌液 3） 加板及孵育：根据菌种类型选择合适的板条，加样，选择适当的温度孵育 16-24 小时 4） 读板：使用读数仪或人工读取板条的结果，通过软件分析得出鉴定结果
3、 使用 BIOLOG 系统对军团菌进行鉴定 英国应用微生物研究中心的科学家使用 BIOLOG 系统，对 20 株军团菌的标准菌株进行
测试（其中不同血清型的嗜肺军团菌 12 株，其它种类的军团菌 8 种），生成用户自定义数 据库，并对环境中分离的军团菌菌株进行鉴定，证明该系统具有很高的的灵敏度和特异性， 可以将军团菌鉴定到种的水平。 1）实验方法
此军团菌的最终鉴定需要综合它的生物学特性进行综合分析，即形态、生化性状、分子生物 学检测（PCR、16SrRNA）、抗体检测（IFA、ELISA）。 1、 标本直接检查
直接显微镜检查：涂片革兰染色及 Gimenez 染色，但意义不大 2、 核酸检测
采用 DNA 探针及 PCR 扩增 rRNA 的方法均可用于军团菌的快速诊断。原位杂交技术可 利用特异性核酸作为探针对组织细胞进行杂交，以确定有无军团菌感染。PCR 与传统方法 相比有着更高的灵敏性，如果实验过程操作严格，引物选择适当，有较好的特异性。
NCTC 11370 杜氏军团菌
NCTC 12022 菲氏军团菌 NCTC 12010 以色列军团菌
NCTC 11979 哈氏军团菌 NCTC 11477 长滩军团菌血清型 1 型
NCTC 11371 麦氏军团菌
NCTC 11192 嗜肺军团菌血清型 1 型
NCTC 11230 嗜肺军团菌血清型 2 型
PCR 检测中要特别注意是否会有其它同军团菌属相近的细菌得到非特异性扩增，另外 由于假阳性较高，不能作为确证方法。 3、抗体检测
作为检测军团菌感染临床常用手段，检测病人血清中抗军团菌 IgM 及 IgG 抗体可以做 出特异性诊断。IgM 抗体为近期感染，IgG 抗体可在体内持续数月，供流行病学的调查。常 采用方法包括：间接免疫荧光法（IFA）、微量凝集试验（MAA）、试管凝集试验（TAT ）、
军团菌检测及其新方法
一、 军团菌概述 1、分类
1976 年在美国费城举行退伍军人集会期间，爆发了不明原因的流行病，以发热、咳嗽 为主的呼吸道感染。与会者 149 人发病，其他人员 72 人发病，34 人死亡。事实上，早在 1943 年该菌就曾在豚鼠中分离出来。
1978 年美国 CDC 及 WHO 在亚特兰大正式将其命名为军团杆菌。1984 年《伯杰系统细 菌学手册》定为军团菌科，军团菌属（Legionella）。该菌属较为复杂，时有新种发现，现已 命名的菌种分别来自人体和环境，共有 39 种及 3 个亚种，60 个血清型。 2、临床意义
不同的细菌会利用不同碳源（或氮源）进入新陈代谢过程（即呼吸链），而对其它一些 碳源（或氮源）则无法利用。将每种细菌能利用和不能利用的一系列碳源（或氮源）进行排 列组合，就构成了该种细菌特定的代谢指纹。
细菌在利用碳源进行新陈代谢的过程中，呼吸链产生电子，将 TTC（四唑紫）指示剂 由无色的氧化型转变为紫色的还原型。通过肉眼观察或计算机控制的读数仪，将反应结果同 数据库中的指纹进行比对，从而得到细菌的鉴定结果。
d． BIOLOG 系统并不是专门针对军团菌的，因此在进行军团菌的鉴定时，需要对系统的操 作流程进行改良，确定适合军团菌的实验方法，包括培养基的选择、接种前的培养时间、 孵育条件等等，都有待进一步摸索，以期获得理想的鉴定效果。
NCTC 11232 嗜肺军团菌血清型 3 型
NCTC 11405 嗜肺军团菌血清型 5 型
NCTC 11287 嗜肺军团菌血清型 6 型
NCTC 11984 嗜肺军团菌血清型 7 型
NCTC 11985 嗜肺军团菌血清型 8 型
NCTC 12000 嗜肺军团菌血清型 10 型 NCTC 12179 嗜肺军团菌血清型 11 型
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微生物鉴定系统对军团菌进行鉴定，为军团菌的检测提供了新的思路和方法。 1、 BIOLOG 的鉴定原理
20 世纪 80 年代初，美国 BIOLOG 公司研发了一种全新的细菌鉴定方法——代谢指纹法， 该方法不再简单地依赖检测生化反应的产物，而是通过进入细胞呼吸链的方法，更加灵敏地 检测细菌在新陈代谢过程中对碳源或氮源的利用情况。
4） 讨论： a． BIOLOG 系统最主要的优势是细菌在鉴定过程中不需要完全生长，只要表现出代谢活
性，就能将反应底物中的指示剂由无色变为紫色。根据军团菌的特点，对 BIOLOG 系统 的检测流程进行改进，采用利于菌落生长的 Buffered Charcoal-Yeast Extract （BCYE） 培养基，调整菌液浓度和培养环境，适当延长孵育时间，可以将军团菌至少鉴定到种水 平，且具有相当好的灵敏度和特异性。 b． 一直以来，军团菌被认为是苛氧菌，很难通过一般的培养和生化反应进行鉴定。上述研 究表明，军团菌可以代谢 BIOLOG 板条上大部分的碳源或氮源，其反应的结果与已知军 团菌的代谢特征基本吻合。（见下表）
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a-Ketobutyrate a-Ketovalerate Propionate Succinate Alaninamide L-Alanine L-Alanylglycine L-Asparagine L-Aspartate L-Glutamate Glycyl-L-aspartate Glycyl-L-glutamate L-Histidine L-Leucine L-Ornithine L-Proline L-Serine L-Threonine ?-Aminobutyrate Urocanate
（95%的氮气-5%的二氧化碳）。 孵育时间：24 小时
2） 生成用户自定义数据
对下列 20 株 NCTC（United Kingdom National Collection of Type Cultures）的标准军团
菌进行检测，根据检测结果生成用户自定义数据库：
NCTC 11368 博氏军团菌
近年来，国内感染军团菌的病例时见报道 。值得注意的是军团菌病的临床表现是多种 多样的，高发于夏秋季节，易侵犯患有慢性器质性疾病或免疫功能低下者 ，如恶性肿瘤、慢 性支气管炎或肺气肿等患者，以及使用激素及免疫抑制剂和器官移植的患者。军团菌在条件 致病菌和院内感染中的位置也越来越被人们所重视。
二、 军团菌的常规检测 军团菌的营养要求苛刻，生长缓慢，在氧气含量低的情况下生长速度会进一步减慢，因
接种条件：配置菌悬液的液体培养基为 Page's Amoebal Saline (PAS)，菌悬液浓度为 A590nm =0.55~0.6（约 1.3×109~1.7×109CFU ml-1）。
培 养 温 度 ： 37℃ 培养条件：氧气 4%的低氧环境，在厌氧箱中加入 0.2 的空气和 0.8 的厌氧气体混合物