无菌操作和纯培养技术

起、边缘、颜色、 透明度、湿润度等
大肠杆菌在EMB、MFC、远藤氏培养基菌落
二. 用固体培养基获得纯培养
菌 苔 （lawn）
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便
成菌苔。
菌苔 菌 落
二、用固体培养基分离纯培养
使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的方法：
稀 释 ！
二、用固体培养基分离纯培养
稀释倒平板法
二. 用固体培养基获得纯培养
纯培养( pure culture )
只有一种微生物的培养物。微生物学中通常将由一个 细胞生长、繁殖所形成的群体称为纯培养。
自然状态
wk.baidu.com纯培养
纯培养技术
把某种特定的（目标）微生物从自然混杂存在的状态中 分离、纯化出来，以便被研究和利用。
二. 用固体培养基获得纯培养
平皿（Petri dish ） 由玻璃或透明塑料制成的圆形皿底和皿 盖组成，皿盖可覆盖于皿底之上，防止 空气中微生物的污染。 培养 平 板（ culture plate ） 常简称为平板，指固体培养基 倒入无菌平皿，冷却凝固后所 形成的培养基平面。
2.1 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术(aseptic technique)
无菌技术
灭 菌
分离、培养微 生物的器具不 含任何微生物
无菌操作
转接时防止其 它微生物污染， 也防止污染环 境
无菌技术
高压蒸汽灭菌
灭 菌
分离、培养 微生物的器 具不含任何 微生物
高温干热灭菌 高温灼烧 过滤除菌
紫外线照射等
微生物的纯培养和显微技术
微生物学基本实验技术
显微技术
染色技术
无菌技术 培养基制备 消毒灭菌 分离纯化 菌种保藏
微生物学基本实验技术
1
2
3
无菌技术
纯培养 技术
显微技术
？
？
？
2.1 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术(aseptic technique)
无菌技术
在分离、转接及培养纯培养物时防止其 被其他微生物污染，其自身也不污染操作环 境的技术
This is an example of how NOT to streak for isolation. Scribbling is not streaking, and most likely will not result in isolated colonies.
4. 稀释摇管法
单菌落
光学显微镜一般配置的最大放大倍数： 目镜：10 ~ 15 ╳ 物镜： 100 ╳ 总放大倍数 1000~1500 ╳
思考： 放大倍数为400倍的两组镜头，观察效果
是否相同？（1）目镜10×，物镜40×；（2）目镜 4×，物镜100×
2. 暗视野显微镜
梅毒螺旋体
(×500)
团藻和绿藻
(×175)
适用厌氧微生物的分离
三. 用液体培养基分离纯培养
顺序稀释，高度稀释，使一支试管中分配不到一 个微生物。
采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释 度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%） 表现为不生长。
不生长管 生长管
采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释 度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%） 表现为不生长。
3.相差显微镜
迂回螺菌
(×210)
肉毒梭菌
(×600)
草履虫
(×100)
4.荧光显微镜
大肠杆菌 （×600）
草履虫 （×125）
鞭毛虫 （×1000）
藤黄微球菌 蜡状芽胞杆菌
5.透射电子显微镜
深红螺菌 （相差） ×600
深红螺菌 (TEM) ×100 000
人类流感病毒 (TEM) ×280 000
涂布平板法培养结果
2. 稀释倒平板法
对好氧菌和热敏感菌效 果不好 即可定性，又可定量， 用途广泛
3. 平板划线法
3. 平板划线法
Mixed culture
Pure culture
画完一个区 域后，应将接 种环灼烧后， 再进行划线
画完一个区域后，应将接种环灼烧后，再进行划线 一般A＜B ＜ C ＜ D，且各区夹角一般为120°
四. 单细胞（孢子）分离
究反行用 中比。单 采，难细 用限度胞 。于与分 高细离 度胞器 专或， 业个在 化体显 的的微 科大镜 学小下 研成进
五. 选择培养分离 （固体培养基分离）
根据某种微生物的生长需要，设计一套特定环境
条件使之特别适合这种微生物的生长，以便能够从 自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来， 这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选 择培养分离。
1) 物镜
用香柏油取代空气的作用：
空气 当光线从其 n=1.0 ① 增加视野 它介质射入空 照明度，改善 玻璃 n=1.50 气时，折射角 观察效果 大于入射角 香柏油 n=1.52
1) 物镜
用香柏油取代空气的作用：
显微镜分辨 率示意图
1) 物镜
0.5 λ
能分辨的最小距离（D）= ———— n sin θ
Mixed culture
Swab from sole of shoe 鞋底试样
Oral swab 口腔试样
Each colony was examined microscopically
2.1 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术(aseptic technique)
无菌技术
在分离、转接及培养纯培养物时防止其 被其他微生物污染，其自身也不污染操作环 境的技术
革兰氏阳性菌等电点：2~3
革兰氏阴性菌等电点：4~5
1. 利用选择平板进行直接分离
待分离的微生物生长
其它微生物的生长被抑制
高温下培养：分离嗜热细菌 培养基中不含N：分离固氮菌
培养基加抗生素：分离抗性菌
1. 利用选择平板进行直接分离
待分离的微生物的生 长特征明显不同于其 它微生物
待分离的微生物的生 长特征明显不同于其 它微生物
酪素平板：分离蛋白酶产 生菌
二. 用固体培养基获得纯培养
菌 落 （colony）
霉菌
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部 生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。
酵母菌 酵 母 菌
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
大小、形状、隆
2. 富集培养
加入滤纸条的 液体培养基
刚果红平板
图 利用富集培养技术从土壤中分离纤维素降解微生物
2. 富集培养
图 利用富集培养技术从土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物
2.2 显微镜和显微技术
一. 显微镜种类及其原理
1.普通光学显 微镜
1) 物镜
低倍镜
高倍镜
油镜（OI）
镜头和玻片间以 香柏油 代替空气
♪ 静 ♪ 快
关好门窗, 避免空气流动过快 不宜四处走动 操作者不讲话,他人也不要在操作处讲话 操作熟炼 动作快速
♪ 轻
打开或盖上 瓶口的动作要 轻 接种操作动 作要轻
二. 用固体培养基获得纯培养
培养物(culture)
在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。
空气中的微 生物
Petri dish
culture plate
二. 用固体培养基获得纯培养
菌 落 （colony）
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部 生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌落
二. 用固体培养基获得纯培养
菌 落 （colony）
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部 生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。
6.扫描电子显微镜
金黄色葡萄球菌 （×32 000）
脊螺旋体 （×6000）
二. 显微观察样品的制备
分辨率 : 放大 : 反差: 能辨别两点之间最小距离的能力 放大倍数 被观察物区别于背景的程度 被观察物区别于背景的程度 样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响 着显微观察效果的好坏
光学显微镜的制样
涂布平板法 平板划线法 稀释摇管法
平板分离
（最常用）
1 mL 1.dilute sample 1 mL 9 mL
Original sample
10-1 10-2
10-3 10-4 10-5 10-6
2. plate out 0.1 mL
1. 涂布平板法
使用较多的常规方法， 但有时涂布不均匀 即可定性，又可定量， 用途广泛
待分离的微生物的生 长特征明显不同于其 它微生物
刚果红平板：分离纤维素 酶产生菌
待分离的微生物的生 长特征明显不同于其 它微生物
淀粉平板：分离淀粉酶产 生菌
2. 富集培养
取样
“投其所好” （液体培养）
特定的环境条件培养
适应于该条件的微生物旺盛生长
待分离微生物在群落中的数量大大增加
选择培养基分离到所需的特定微生物
压滴法 悬滴法 1.活体观察
菌丝埋片法
插片法
适于放线菌、霉菌
小培养法
光学显微镜的制样
2.染色观察
简单染色 正染色 鉴别染色 1.死菌 负染色：荚膜染色等 2.活菌：美兰等 革兰氏染色 芽孢染色 抗酸性染色 姬姆萨染色
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
肺炎链球菌
常用染料
碱性染料 美兰、结晶紫、孔雀绿、碱性复 红等（染料离子带正电） 酸性染料 伊红、酸性复红、刚果红等（染 料离子带负电）
无菌技术
无菌操作
转接时防止其 它微生物污染， 也防止污染环 境
酒精灯火焰附近进行； 在无菌箱或操作室内无菌的 环境下进行
超净工作室，超净工作台
无菌操作前的准备工作： 超净工作台的紫外灯灭菌 75%乙醇消毒手 点燃酒精灯
斜面接种时的无菌操作
倒平板的无菌操作
无菌操作三要点
1) 物镜
0.5 λ
能分辨的最小距离（D）= ———— n sin θ 数值孔径（NA） n：玻片与物镜间介质的折射率 θ:为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和 工作距离
低倍镜
高倍镜
油镜（OI）
1) 物镜
用香柏油取代空气的作用：
② 提高显微镜的 分辨率
2) 目镜
目镜不可以提高分辨率