免疫组化染色步骤
ihc染色步骤
ihc染色步骤
免疫组化染色（IHC）的步骤如下：
1. 组织切片：制作组织切片，要求厚度适宜，以便后续的染色处理。
2. 抗原修复：选择适当的抗原修复液，如柠檬酸缓冲液等，对组织切片进行抗原修复，以暴露抗原。
3. 阻断内源性过氧化物酶：使用内源性过氧化物酶阻断剂，以消除组织中的内源性过氧化物酶活性，避免干扰后续的染色过程。
4. 抗体孵育：将特异性抗体与组织切片进行孵育，使抗体与组织中的抗原特异性结合。
5. 显色：根据选择的抗体和组织情况，选择适当的显色剂进行显色反应，使抗原-抗体复合物呈现特定的颜色。
6. 复染：使用苏木素等染料对细胞核进行染色，以便更好地观察组织结构。
7. 脱水、透明：将染色后的切片进行脱水、透明处理，以便在显微镜下观察。
8. 封片：将处理后的切片用中性树胶封片，避免切片在观察过程中脱落。
以上步骤完成后，即可在显微镜下观察到免疫组化染色的结果。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免 疫 组 化 染 色 步 骤
免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡和水化。
二甲苯I（10min），二甲苯II（10min），二甲苯&酒精1:1（10min），100%酒精（5min），95%酒精（5min），75%酒精（5min），50%酒精（5min），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2.抗原修复（微波炉P-100 4-5min煮沸，P-40 维持15min，每隔4-5 min加一次柠檬酸缓冲液，不能烧干片）。
静置缓慢冷却至室温，组化笔画圈将组织圈起来（离组织边缘1-2mm），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
3.封闭内源性过氧化物酶。
每张切片加适量的3%H2O2（将组织块儿覆盖即可），室温孵育15min（湿盒内，防干片），阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
4.封闭。
每张切片加适量的5% 血清或者脱脂牛奶（PBS配，组织块儿覆盖即可），孵育15分钟（湿盒内），以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
5.除去封闭液，每张切片加适量一抗，室温下孵育60分钟或4℃过夜。
6.PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl放大剂(试剂A)，室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl多聚酶结合物（试剂B），室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
8.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB 或AEC使用说明书），显微镜下观察5-15分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
9.自来水冲洗，苏木素复染（20-30s），自来水冲洗，PBS返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂（详见迈新产品AEC-0038）封片。
可能出现的问题及解决办法:1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
多重免疫组化染色步骤
多重免疫组化染色步骤免疫组化染色呢，开始前得先把组织样本准备好。
这就像是做菜前得把食材洗干净切好一样重要。
要把组织切成合适的薄片，这个厚度可是有讲究的，不能太厚也不能太薄，就像做蛋糕时面粉的量得刚刚好。
接着就是固定啦。
把组织固定住，就像给它拍个快照，让它保持住原本的模样。
一般会用到一些特殊的固定液呢。
固定完了还要进行脱水处理，把组织里多余的水分去掉，这就像是把洗过的衣服拧干水分一样。
然后就是包埋啦。
把脱水后的组织放到蜡块里，就像把小宝贝放进温暖的小窝一样。
这一步可不能马虎，包埋得不好的话，后面的步骤就容易出问题。
再之后就是切片啦。
把包埋好的蜡块切成很薄很薄的片子，这时候就得靠技术了，切得好的片子看起来就很完美。
下面就到了免疫组化染色的关键步骤啦。
要先把切片脱蜡水化，就像给它脱掉厚厚的外套，再让它喝点水恢复活力。
然后用一些特殊的试剂来封闭内源性过氧化物酶，这就像是给组织穿上一层保护膜，防止它受到不必要的干扰。
接下来就是加一抗啦。
一抗就像是小侦探，专门去寻找目标抗原。
一抗要在合适的温度和时间下孵育，就像小侦探要在合适的环境里工作一样。
孵育完一抗后要清洗，把那些没有结合的一抗洗干净，就像打扫卫生一样，把不需要的东西都清理掉。
然后加二抗，二抗就像是小助手，能和一抗结合起来，并且还带着可以显色的标记。
二抗孵育完了也要清洗干净。
最后就是显色啦。
通过一些特殊的显色试剂，让目标抗原显示出颜色来，这样我们就能在显微镜下看到啦。
宝子，多重免疫组化染色虽然步骤有点复杂，但只要细心一点，就可以做好哦。
。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。
（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。
免疫组化染色步骤
免疫组化染色步骤：（两步法）第一天下午一、备片1、5微米厚组织涂有APES的胶片，干燥切片烤片：60℃、60-90min。
至蜡融化组织贴在玻片上。
2、二甲苯脱蜡：15minX3。
至蜡消失。
可第一缸时间较长，第二三缸较快。
需上下提洗，加快速度。
3、水化：梯度酒精水化（100%，90%，80%）入自来水。
如未洗净，则片子看上去有油腻感。
洗至看上去非常干净。
也宜上下提洗。
二、免疫组化染色1、3%双氧水封闭10-15min。
（注：现用现配，30%双氧水用蒸馏水稀释1：10）；蒸馏水洗一次，冲一下即可。
2、依据抗体说明热修复，高火每盒3min，然后低火12min。
过夜。
一些抗体比较特殊：CD68、Vimentin、S－100水化后胰酶消化15min，用TBS冲干净后，放入缓冲液中过夜；Kappa、Lambda需修复两次，即低火12min两次；第二天上午3、擦干背面及组织周围的水（注意：分清正反不要擦掉组织）；加1XTBS稀释后一抗30-50微升/张（注：一般为1：50；多抗1：100；可依据抗体说明书摸索）室温40min，TBS洗5min×3次；4、加A液（聚合物增强剂）20min，TBS洗3min×3次；5、加B液（二抗即酶标抗鼠/兔聚合物）30min，TBS洗3min×3次；6、DAB显色（A液B液15μl/1000μl，现配现用）3-10min。
7、显微镜下观察显色满意后自来水终止显色。
8、用Mayer’s苏木素复染核（新配1－2min），分化（盐酸酒精），返蓝（自来水）。
三、脱水（80%，90%，100%酒精）；透明（纯二甲苯3X5min）；封片。
免疫组化配液一、1XTBS：(5000ml，1XTris-NaCl，PH=7.6)二、修复液1、0.01M枸橼酸盐缓冲液：（1000ml，PH=6.0）配置前摇匀，配后摇匀测PH值。
2、10XTris-EDTA抗原修复液：（500ml，PH=9.0）用前稀释10倍3、Mayer’s苏木素甲液：苏木精1g，无水酒精20ml。
免疫组化染色步骤
免疫组织化[检验原理]生物素标记的山羊抗小鼠/兔lgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物，聚合物上的HR催化底物过氧化氢与DAB (或AEC) 反应，最终形成棕褐色(或红色)不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定杭原的位点。
[试剂]1:内源性过氧化物酶阻断剂试剂2:封闭用正常山羊血清工作液试剂3:生物素标记山羊抗小鼠兔lgG试剂4:辣根酶标记链霉卵白素工作液[储存条件及有效期]2~ 8C避光保存，不得冻存:产品有效期为12个月。
使用时即拿即放，使用后应立即放回冰箱，开封后试剂有效期6个月。
[样本要求]1、标本类型:活检或手术切除标本。
2、标本固定:所有组织标本离体后(1小时内)尽快采用10%中性缓冲福尔马林固定，固定液与所浸泡组织的比例应足够。
固定时间以8~72小时为宜。
3、组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。
切片厚度3~ 5μm 黏附在防脱玻片上，56~ 60摄氏度烤片2小时。
[检验方法]1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。
2、试剂准备:显色液需要在使用前配制。
3、操作程序:a) 脱蜡和水化石蜡切片置于新鲜二甲萃中，浸泡10分钟x3次:去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟x3次:去除多余的液体后，置于95%乙醇中,浸泡3分钟x2次:去除多余的液体后，置于75%乙醉中，浸泡3分钟x2次:蒸馏水冲洗1分钟，蹕于PBS缓冲液中。
b) 抗原修复，参见抗说明书。
c 阻断内源性过氧化物酶加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟心3次。
d)滴加封闭用正常山羊血清工作液滴加100uL或适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去血清，勿洗。
e)滴加一抗根据组织大小，滴加100pL或适量的抗，37*C孵育60分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次f) 滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔lgG滴加10uL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG,室温孵育10-15分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次。
免疫组化 ABC法
免疫组化染色步骤(ABC法)第一天：【准备：试剂、37℃恒温水箱打开】1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol 内浸泡5min。
【二甲苯→二甲苯→100% Alcohol→100% Alcohol→95% Alcohol→90% Alcohol→80% Alcohol→70% Alcohol】2．TBS洗10 min×3，置摇床上。
3．【注意避光】用0.3% H2O2和0.3%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上。
增加切片渗透性。
【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2】4．TBS洗10 min×3，置摇床上。
5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL 0.05M Citrate buffer（或0.05M Tris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95o C左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．TBS洗10 min×3，置摇床上。
【如果掉片严重，5、6和3、4调换一下】7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20 -30 min。
8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。
加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。
9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。
第二天：【准备：37℃恒温水箱打开】10. 取出湿盒（室温30 min，恢复到室温），将抗体倒掉，TBS洗10 min×3，置摇床上。
11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12. 取出湿盒，将Π抗倒掉，TBS 洗10 min×3，置摇床上。
免疫组化染色操作顺序
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学IHC又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针,检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术.免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性.间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶PAP法、亲和素—生物素—过氧化物酶ABC法和链霉亲和素—过氧化物酶SP法.PAP法一抗和二抗均不标记,避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体,与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物含3个酶分子和2个抗体分子,染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本,最后用H2O2和二氨基联苯DAB为底物显示过氧化物酶,即可检测标本中的抗原成分.生物素为含硫的杂环单羧酸,可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合,从而标记抗体和酶.亲合素又称抗生物素蛋白,与生物素有很高的亲合力,1分子亲合素可结合4分子生物素,ABC法即在此基础上建立.ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合,制成ABC复合物,并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点.在标本孵育过一抗和二抗后,再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB进行显色.ABC法的敏感性较PAP法更高.图1.免疫组织化学基本原理示意图引自八年制组织学与胚胎学SP法与ABC法相似,其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶.在标本孵育过一抗和二抗后,加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB进行显色.与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低.SP法简化了操作步骤,同时也减少了非特异性背景,是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术.二、实验准备：1.标本准备①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理②冰冻组织切片：由病理室常规处理③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞,待细胞生长达到60％以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2h.2.试剂准备①抗体选择单克隆抗体针对单一表位,具有较高的特异性,但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位,可避免单克隆抗体的缺点,但是可能出现非特异性杂交.因此,不论选择单克隆还是多克隆抗体,最好同时购买两个货号的抗体,购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体,抗体说明书上必须有IHC测试结果.如果该分子文献报道较多,可选择文献上常用的经典抗体.②二抗试剂盒目前本实验室所用二抗试剂盒为LifeTechnologiesHistostain-PlusKitHRP,BroadSpectrum,货号85-9043,一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠.③DAB试剂盒目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒,货号DAB-2032.④其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶3.抗体特异性验证所有免疫组化抗体均须Westernblot验证抗体特异性,并需免疫荧光实验验证抗原定位.4.耗材准备免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片5.溶液配制①磷酸盐缓冲液PBS10×PBS母液配制NaCl 72gNa2HPO4·12H2O 37.3gKH2PO44.3g加蒸馏水至1000ml,充分混匀贮存.使用时用蒸馏水10倍稀释,调整pH值至7.3—7.4.②柠檬酸抗原修复液抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,配方如下：称取柠檬酸10.5g,溶于500ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O57.3g,溶于800ml蒸馏水.分别量取358ml柠檬酸溶液和642mlNa2HPO4溶液,充分混匀后调整pH值至6.0,即得2×母液,贮存备用.③1%盐酸酒精浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合,充分混匀.三、免疫组化操作步骤1.组织片脱蜡水化①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡,每缸15min.②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸,每缸5min.③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸,每缸5min.④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸,每缸2min,取出.⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复3次.2.抗原修复将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中,高压煮沸后继续加热2min,然后停止加热让切片自然冷却.注意：抗原修复过度或不足,均会影响最终染色结果.切片骤冷可致脱片,必须自然冷却3.封闭内源性过氧化氢酶①放入3%H2O2溶液的玻璃缸中,浸泡15min.②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复3次.③放入PBS缓冲液的玻璃缸中,浸泡5min.4.抗体杂交①甩去PBS余液,将组织片平辅在湿盒中,加正常山羊血清1滴20μl试剂盒中的A液,根据组织大小调整用量,28℃放置20min,甩干.②加稀释好的一抗1滴20~50μl,根据组织块大小进行调整,置于湿盒4℃过夜.③置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5min,更换PBS缓冲液,同法操作4次,甩干.④加入生物素偶联的二抗20~50μl试剂盒中的B液,根据组织块大小进行调整,放置湿盒,37℃放置20min.⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5min,更换PBS缓冲液,同法操作3次,甩干.5.显色①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50μl试剂盒中的C液,根据组织块大小进行调整,湿盒内28℃放置5~20min,甩干.②置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5min,更换PBS缓冲液,同法操作3次,甩干.③滴加新鲜配制的DAB工作液100μl以覆盖组织为宜,放置观察反应部位呈现黄褐色时3~5min,置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；6.复染浸入苏木精溶液中复染,放置5min后,用自来水反复涮洗至水不变色,再用1%盐酸酒精分化1—2s后,自来水冲洗后,反蓝水洗2min.7.脱水、透明和封片①依次放入95％、95％乙醇溶液的玻璃缸中,每缸浸泡5min,取出；②依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中,每缸浸泡5min,取出.③依次放入2个装有二甲苯的玻璃缸中,每缸浸泡5min,取出.④滴加适量中性树胶,封片,晾干.8.注意事项①整个染色过程中组织块要保持湿润,不能干片,否则会导致非特异性染色.②组织切片边缘易干,因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块,避免干片.四、结果判定1.阳性细胞判断DAB显色呈黄色.每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础,才能对染色结果作出判断.抗原表达必须在特定部位,对于临床诊断来说,不在抗原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性.尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致,不能视为阳性.2.抗原表达评价免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标,实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量,我们常用的免疫组化评分方法如下：细胞染色强度评分：0无染色,1弱染色,2中染色,3强染色肿瘤细胞阳性率评分：00~9%,110%~25%,226%~50%,351%~75%,476%~100%将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值.。
免疫组织化学染色的实验步骤及注意事项
十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。
3、自来水冲洗5min。
4、蒸馏水冲洗3遍。
5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。
6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。
7、PBS浸泡5min*3次。
8、3%的H2O2封闭30min。
9、蒸馏水冲泡2次。
10、PBS浸泡5min*3次。
11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。
13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。
18、流水中止，流水冲洗5min。
19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。
20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。
21、二甲苯透明各15min。
22、用中性树胶封片。
盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水化。
2.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3.蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。
4.5~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃。
5.PBS冲洗，5分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7.PBS冲洗，5分钟×3次。
8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9.PBS冲洗，5分钟×3次。
10.显色剂显色（DAB或AEC）。
11.自来水充分冲洗，复染，封片。
12.冰冻切片免疫组化染色步骤。
13.冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分
钟，PBS洗，5分钟×3.用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤
1.准备染色：将需要染色的组织切片用4%-10％的甲醛溶液处理，然后放入0.2%的甲醛溶液中浸泡10-15分钟，除去水分后，用石蜡或玻璃滑片冰冻干燥后备用；
2.细胞选择：将滑片放在温度为60℃的预处理室内，经过5分钟的预处理，清除细胞的表面活性物质；
3.免疫化学染色：选择适宜的免疫染色培养液，将其放入干燥的滑片上，放入正常培养的锅炉内，温度在37℃；持续室温处理60min，以停止免疫反应；
4.洗涤：将染色滑片放入PBS洗涤3次，每次洗涤10min，使抗体与反应物完全稳定，以避免多余的洗涤对结果的干扰；
5.染色：将抗体连接到细胞上，使用应用适当的洗涤液将染色滑片淋洗；然后使用适当的染料进行染色，建议使用DAPI染色，因为其能够在高度细胞存在下染色，或者使用其他染色方法，比如无铁紫藤染色，铜绿假单胞菌染色等；
6.滤过：将染色滑片分批放在滤纸上，进行滤过，以减少染料在细胞上积累的可能性；
7.拍摄：使用荧光显微镜拍摄染色细胞，绘制免疫组化染色的结果图片，为最终研究结果的分析提供数据支持。
免疫组化HE染色步骤
骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织,用PBS冲洗,放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h;2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次,再用50%的酒精冲洗2次,常规脱水,70%酒精60min,80%酒精40min,95%酒精30min,100%酒精125min,100%酒精II25min;4.透明：二甲苯I35min,二甲苯II35min;5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时,石蜡II1小时;6.切片：包埋后的组织块经修理后,用切片机切成4um的石蜡带,将组织石蜡块在50℃温水中展片,然后用干净的载玻片捞片;7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时;免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯110min二甲苯210min;2.水化：100%酒精12min100%酒精2min95%酒精2min80%酒精2min70%酒精2min;冲洗3次,每次5min.;4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液中煮沸15min,自然冷却至室温;冲洗3次,每次5min;6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性; 冲洗3次,每次5min;8.滴加1抗GFP1：100稀释,4℃过夜冲洗3次,每次5min;10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1,37℃孵育,20min,PBS冲洗3次,每次5min;11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2,37℃孵育,20min,PBS冲洗3次,每次5min;显色5min;13.自来水冲洗10min;14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化;15.自来水冲洗10min;16.常规脱水,透明,封片,镜检;组织切片HE染色步骤1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1,二甲苯II进行脱蜡各10min;2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min,PBS冲洗2次,每次5min;3、苏木素染色3min,自来水冲洗3min,1%盐酸酒精分色2s,自来水冲洗2min,依次浸入50%、70%、80%的酒精中各2min,伊红浸泡5s,自来水冲洗3min;4、再将组织切片依次侵入95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中各3min,最后再依次侵入二甲苯I,二甲苯II各5min;5.中性树胶封片,镜检;。
免疫组化染色
免疫组化染色一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
（1）二甲苯I、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟→ 95%，2分钟→ 80%，2分钟→ 70%2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000mlB液：枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml抗原修复的方法：（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟.（最佳温度为92~95℃）（3）酶消化处理：此略。
抗原修复的注意事项：（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50μl+5μl (10%抛洒量)计算。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
免疫组化步骤
免疫组化染色步骤1、常规脱蜡至水二甲苯I 20min；二甲苯II 20min；100%乙醇5min；95%乙醇5min; 80%乙醇5min；70%乙醇5min; 蒸馏水5min。
2、消除内源性过氧化物酶3%H202处理30min，蒸馏水冲洗5min×2次。
（3%H202配制：30ml的30%的双氧水溶于300ml蒸馏水，搅拌均匀）3、微波修复将切片置于0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液中，微波修复至刚刚沸腾，隔5分钟后再一次加热至即将沸腾，重复2-3次，取出后自然冷却。
PBS冲洗5min×3次。
此步骤很关键，修复时要时刻观察，一沸腾即要关闭微波炉，要不然片子上的组织很容易脱片，而且修复过久容易到时假阳性，即基本是所有的细胞都染色了颜色。
（0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液的配制：柠檬酸钠3g，柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水，最终PH＝6）4、封闭非特异性抗原结合位点用5%BSA滴加到目标组织上，放入湿盒内在37度孵育20min，甩去多于液体。
（5%BSA溶液配制体系为2ML：0.1gBSA溶于2ML的PBS中）5、滴加一抗滴加一抗于目标组织上，放入湿盒内，40C冰箱过夜。
（一抗需要用PBS稀释）6、滴加二抗从40C冰箱取出湿盒，使其自然恢复至室温，PBS冲洗5min×3次，滴加二抗于组织上，37度25min，PBS冲洗5min×3次。
7、滴加SABC滴加SABC于组织上，370C放置25min，PBS冲洗5min×3次。
8、显色将试剂盒中的ABC三种试剂按顺序依次滴加一滴于1ml蒸馏水中，混匀，滴加到目标组织上。
通过观测组织颜色的变化情况来确定显色时间。
根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在3-10min左右，最常用5min。
自来水冲洗：自来水充分冲洗10-15min,注意：冲洗的时候要注意水流不要太大，缓慢的冲洗。
9、复染苏木素复染5至10 S，自来水冲洗数分钟（在自来水中晃动），若染色过蓝，可以放入0.5%盐酸酒精中分化数秒（摆两下就好），再在自来水中晃动。
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④ 冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤ 第二次作用：标本加标记的荧光抗体溶液，放入湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
⑥ 冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦ 观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。
（4） 冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
（5） 观察：标本晾干或者加介质（缓冲甘油液）和盖片观察。
直接法首次试验时需作以下对照：
标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色，呈阴性反应。
标本先加同类未标记抗体作用30分钟后，PBS冲洗，再加荧光标记抗体染色。因标记内抗原已未标记的特异性抗体反应，不再与荧光抗体结合，所以应呈现阴性反应。
1、直接染色法
直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应，是免疫荧光技术中最基本、最简单的染色方法。
（1） 固定：切片或涂片标本用95℃乙醇或丙酮固定。
（2） 冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
（3） 染色：滴加相应的荧光抗体液，将标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
④ 冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤ 第二次作用：标本滴加荧光抗体（抗体Ⅱ）液，再放入湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
⑥ 冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦ 观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。
首次试验时需作以下对照：
① 标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体，呈阴性反应。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
2、间接染色法
间接染色法分双层法和夹层法
（1） 双层法：双层法主要定位抗原和鉴定未知抗体。
① 固定：标记用丙酮或95%乙醇固定。
② 冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
③ 第一次作用：被检标本滴加未标记的第一抗体液，并将其放入带有湿纱布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
Байду номын сангаас
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
② 标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，再加抗免疫球蛋白荧光抗体溶液染色。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
（2） 夹层法：夹层法主要示踪细胞内的免疫球蛋白
① 固定：标本用丙酮或95%乙醇固定。
② 冲洗：PBS冲洗。
③ 第一次作用：标本首先滴加与标本内抗体相应的抗原，放湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
8. PBS冲洗，2分钟×3次。
9. 显色剂显色（DAB或AEC）。
10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
荧光抗体染色方法
免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小，不溶解或不变性，原有位置不扩散或不移位。因此，对标本的处理一般速度要快，温度要低。恒冷切片和涂片较为理想。因此，抗体溶液的pH值和反应温度越低，孵育的时间越长。一般37℃时需要25~60分钟。若要作细致观察或者当天不能进行染色标本的观察，可在5℃中过夜，但染色标本最好是当天观察。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。