禽流感病毒的分离与鉴定技术

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禽流感的流行特点和检测技术

中国动物保健2021.06禽流感（avian influenza ，AI ）的潜伏期一般较短，通常为4～5d 。

发病时精神沉郁，食欲、饮欲降低甚至废绝，被毛散乱，体温升高，趴卧不动，偶有流泪。

头部、面部水肿，脚鳞发紫出血，肉垂和鸡冠呈干枯紫色，甚至坏死。

呼吸困难，咳嗽，听诊呈啰音；下痢，粪便呈淡黄或白色。

出现神经症状，共济失调，不能站立或行走。

并且该病为人畜共患病，处理不好不但会危害养禽业的经济发展，还会危害人类身体健康。

1禽流感的流行病学特点1.1传染源主要由感染或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，野外野生鸟类，特别是迁徙性水禽相互传染所致。

1.2传播途径主要通过病禽的分泌物、排泄物、尸体，污染的饮水、饲料和其他物体，直接或间接接触引发感染，主要感染途径为呼吸道和消化道，以及直接接触病毒毒株感染。

人工接种可通过气溶胶经口鼻内、气管内、眼结膜、腹腔、肌肉、静脉和泄殖腔内等途径使易感禽类感染。

1.3易感动物禽流感病毒在世界范围内广泛分布。

许多家禽、野禽、人类、特别是鸭等迁徙水禽，发生病毒感染的概率比其他禽类高，而家养的鸡和火鸡所发生的流感最为严重。

1.4特点多为大流行，世界范围流行。

过去呈三年小流行，五年大流行。

该病主要在寒流较多，气温变化大的秋冬、冬春交替季节流行。

2禽流感的检测技术2.1血清学诊断技术中和试验中和试验的操作步骤复杂，容易造成材料的浪费，临床上不常用，但其为最原始的病毒检测技术，常用来做标准与其他检测方法作比较。

本试验常用鸡胚或组织培养细胞作为样本鉴定禽流感病毒。

中和试验是具有高度的灵敏性和特异性的血清学方法，抗体只和病毒上表面抗原相对应，特别是已吸附的宿主细胞上的病毒颗粒表面的抗原相对应。

所以，在某种特定血清型的中和实验中，抗体只和组内的其他病原发生有限的交叉反应。

琼脂扩散试验琼脂扩散试验检测禽流感时，以具有血凝素活性的鸡胚尿囊液作为样品，采用已知的阳性血清和未知抗原进行病毒抗原型的特异性鉴定。

H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验

H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验作者：许佳敏边海霞来源：《中国动物保健》2021年第01期摘要：为了更好防控H9N2亚型禽流感，且做到科学免疫，免疫减负。

本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料，将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离，通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。

结果显示：分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒（AIV）；血凝试验（HA）效价在10～11，该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支。

将病毒纯化后，制备灭活疫苗免疫SPF鸡，免疫后14d对其进行HI检测，结果显示其效价到达峰值为10Log2，免疫后28～35d其平均效价在9.6Log2，至免疫后12周平均效价在7Log2。

结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果，可以作为疫苗候选株。

关键词：H9N2亚型禽流感毒株，免疫，疫苗禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza，AI）的简称，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae）、流感病毒属（influenza virus）、A型流感病毒（influenza A virus）引起的禽类疾病[1]。

国际兽医局（OIE）将禽流感列为A类动物疫病，我国也将其定为一类动物传染病。

H9N2禽流感病毒是低致病性亚型，在世界各地家禽群中流行。

目前，H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行，虽然死亡率低，但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常，产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋，鸡群产蛋率下降30%～80%，病程持续时间长的可达月余，造成严重的经济损失[2]。

该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快，不同血清型之间交叉保护有限；所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义[3]。

本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株，并进行动物试验，为进一步筛选疫苗提供理论依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源疑似发病鸡病料，采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

３７℃孵化４８ｈ后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价，将具有血凝价的鸡胚尿囊液分别与ＮＤＶ、蛋综合征减
病毒、Ｈ５亚型禽流感病毒的标准阳性血清进行血凝
１材料与方法
１１材料．
抑制（）ＨＩ试验，体操作程序按照世界动物卫生组具织（Ｅ的标准方法进行，鉴定过的病毒分装，ＯＩ）将保存于一７Ｃ备用ｊ０。。１２２病毒特异性片段的ＰＲ扩增以及序列测定．．Ｃ
２５。００
关键词：流感病毒；Ｈ５禽Ｎ２亚型；定；鹉鉴鹦
中图分类号：８２６９５￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０００ — ０７０１０ — ０８２１）４０５ — ３
禽流感（ｉｎｉｆｅｚ，）是由Ａ型流感病ＡｖａｎｌｎａＡＩｕ
１２１病毒的分离及ＨＡ亚型鉴定将采集的鹦．．
鹉源拭子按照世界动物卫生组织的国际标准方法处理，种１日龄ＳＦ鸡胚尿囊腔，胚０１ｍＬ，接０Ｐ每．
型禽流感病毒暴发的报道ｌ，宿主源多数集中在３－而］
禽流感病毒流行情况的复杂化，内时有Ｈ５国Ｎ２亚
Ｈ５标准阳性血清由国家动物流感参考实验室提供；鸡新城疫病毒（Ｖ）ＮＤ及减蛋综合征病毒的标准阳性血清由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供。

朱鹮低致病性禽流感病毒的分离与鉴定

没有分离朱鹦流感病毒株的报道。为了解ＡＩ毒Ｖ
株在朱鹦体内的流行状况，试验首次在国内从朱本
１２４鸡胚ＭＤ和Ｌ的测定将所分离毒株．．ＴＤ。用无菌ＨａｋＳｎ液作１Ｏ倍递增稀释，１～ｌ取ＯＯ
表１分离的ＡＩ毒株ＩＰ观察结果ＶＣＩ
ＴａｌＩＩｒｓｌｓｏｓｌｔｄＡＩｂｅ１ＣＰｅｕｔｆｉｏａｅＶ
３讨论
的ＡＩ毒株与鸡的同种亚型ＡＩ毒株在基因组序ＶＶ
ＮＡ）的亚型还有待从病死朱鹦体内分离到１ＡＩ毒株，株Ｖ经鉴定列上的差异以及其神经氨酸酶（
和１稀释，ｏ倍每个稀释度分别以滴鼻点眼的方式接
种５只６龄ＳＦ鸡，只０２ｍＬ，周Ｐ每．连续观察１，０ｄ记录雏鸡发病和死亡情况。按Ｒｅｄｍｕｎｈ法计ｅ— ｅｃ算Ｌ０Ｄ５。１２５１日龄ＳＦ鸡ＩＰ．．ＰＣＩ的测定将所分离的ＡＩＶ毒株用无菌ＨａｋＳ做１：１ｎ液０稀释，脑内经接种２０只１日龄ＳＦ鸡，．５ｍＬ每只，养于隔Ｐ００／饲
Ｌ５Ｄｏ指数为５，Ｐ为１５４ＯＩＩＣ．４。以上结果表明所分离的病毒为低致病力禽流感毒株。
关键词：朱鹨；流感病毒；离鉴定禽分
中图分类号：８２６９５￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０１０ —０２０１０ —０８２１）２０４—３

禽流感病毒的分离与鉴定研究

禽流感病毒的分离与鉴定研究禽流感是一种由禽流感病毒引起的急性传染病。

该病毒主要影响禽类，但也有可能感染人类，并且一旦发生大规模爆发，将对畜牧业、禽类养殖业以及全球经济造成重大影响。

因此，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究至关重要。

分离方法禽流感病毒分离最常用的方法是直接病毒分离法和传代病毒分离法。

直接病毒分离法是将采集来的样品（充气囊液、肠道、气管、内脏等）进行磨碎、过筛后，加入细胞培养基中，通过激活剂或其他手段激发细胞后将病毒从培养基中筛选出来。

传代病毒分离法是将直接病毒分离法筛选出来的病毒，在细胞培养基中通过不断传代，逐渐升高病毒浓度，获得目标病毒菌株。

鉴定方法病毒鉴定是确定所分离的病毒种类的一系列实验。

鉴定方法包括：病理学观察、抗原鉴定和核酸检测。

病理学观察法通常采用组织学、细胞学等方法观察病毒的组织病变和病变情况，以及确定细胞的形态变化和能力损失情况。

抗原鉴定法通过病毒对特异性抗体和特异性酶的反应来鉴定病毒的类型。

常用的抗原鉴定法有酶联免疫吸附试验、荧光免疫分析法、放射免疫分析法等。

核酸检测法是通过核酸杂交技术、PCR扩增和序列分析等方法来鉴定病毒。

其中，PCR扩增技术是最常用的方法之一。

PCR扩增技术可以选择病毒特异性的保守区域，扩增出目标片段，用于比对成果，确认病毒的种类和亚型。

研究进展目前，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究已经取得了一定的进展。

例如，利用新一代测序技术，成功对H9N2亚型进行了全基因组测序和比对，揭示了其与其他亚型的基因组演化关系；同时，也研制出了多种疫苗和抗体，为禽流感的预防和治疗提供了有力的手段。

但是，禽流感病毒的分离与鉴定研究依然存在一些问题，如病毒分离效率低、鉴定方法繁琐、检测灵敏度低等。

为了进一步提高病毒分离和鉴定的精度和效率，需要加强技术研发和人才培养。

总之，禽流感病毒的分离与鉴定研究是保障人民生命健康和畜牧业发展的重要科学问题。

虽然已取得了一定的进展，但研究仍然任重道远，需要继续深入推进。

〖医学〗流感病毒的分离鉴定

取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管中。
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中；混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦㈧㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不管是中医学还是西医学，从二者现有的思维方式的开展趋势来看，均是走向现代系统论思维，中医药学理论与现代科学体系之间具有系统同型性，属于本质相同而描述表达方式不同的两种科学形式。可望在现代系统论思维上实现交融或统一，成为中西医在新的开展水平上实现交融或统一的支撑点，希冀籍此能给中医学以至生命科学带来良好的开展机遇，进而对医学理论带来新的革命。编辑本段现代中医史

禽流感病毒分离鉴定及其NA基因克隆分析

关键词：流感病毒Ｈ５；离；定；禽Ｎ１分鉴ＮＡ基因；ＨＡ基因
中图分类号：３；８２６９２Ｑ９９￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０００ —０６０１００８２１）４０１ —４
２００８年，我国南方某地多家养鸡场发生鸡群在
１２３微量血凝试验（．．ＨＡ）微量血凝抑制试验及
急性大批死亡，鸡鸡冠出『或发绀，部水肿，病ｆ【Ｌ头肌肉和其他组织器官广泛性严晕出血，其产蛋鸡尤群出现严重神经症状，歪向一侧。头站小稳，巢卵
（书医研究所础医学研究审，林Ｋ弁ＩＯ６）。０２３
摘要：疑似禽流感病死鸡病料组织研磨液接种ＳＦ鸡胚分离病毒。囊分离毒经电镜观察后，用将Ｐ尿应
特异性Ｒ — Ｃ方法和血凝及血凝抑制试验进行分型检测，时对核蛋白全长基因进行扩增测序分析通ＴＰＲ同
过血凝及血凝抑制试验初步证实分离的禽流感病毒为Ｈ５亚型，后对分离株ＨＡ基因和ＮＡ基因进行然Ｒ — Ｃ分析，定该分离株禽流感病毒为ＨＮ１亚型。通过ＮＡ全基因扩增测序、ｌｓ分析显示该分离ＴＰＲ确Ｂａｔ株ＮＡ基因序列与已发表的毒株基因序列（Ｕ２７７同源性为９，基因３端发生明显变异。Ｅ４９４）７但

禽流感病毒的分离技术和鉴定方法研究进展

当代医学
２０年２０９，９第１卷第４５期总第１９５期
ＣｎｅｏａｙＭｅｉｎ，Ｆｂ０９Ｖ１１Ｎ．Ｉｕｏ１９ｏｔｍｐｒｒｄｃｅｅ．２０，ｏ．５ｏ４ｓｅＮ．５ｉｓ
禽流感病毒的分离技术和鉴定方法研究进展
的差异。
ｃ之间的某个位置形成纯样品区带；ｍ或用Ｆｃｔ３％－４％Ｗ／ｉｏｌ０，０
Ｗ线性梯度，毒沉降在１１－１１ｇｃ之间；病．３．５／ｍ或用Ｐｒｏｌｅｃｌ作平
衡等密度离心，自形成梯度，毒悬液与Ｐｒｏｌ合，始密度病ｅｃｌ混初
到病毒形态。
甩平转头Ｐ８上海天美肯公司购自）Ｗ２贝克曼）２Ｓ（或Ｓ８（转头，
２，０ｒｍＸ３分钟，＂。０００ｐ０５Ｃ病毒在１０ｇｃ附近形成纯样品区．６／ｍ
作者单位：５６０贵州凯里市人民医院检验科（５００郭秀碧
病毒裂介和进一步对血凝素，神经氨酸酶，ＲＮＡ及其他蛋白
值，以导致动作电位复极时程延长。可这个结果与Ｔ使豚鼠心ＦＣ室肌动作电位的ＡＰＤ延长是相符合的。这样就可以得出结论ＴＦＣ
１分离纯化和观测采集气管粘液或泄殖腔粘液，或病变组织（吸道、呼消化
道）加纯水制作匀浆（０，１％悬液）低速冷冻离心机（，台式或立式均可），０－４００ｐ３００，０ｒｍ，４７ ℃，５２分，１～５１－０弃沉淀，即得到粗

禽流感各种诊断技术的比较

诊断速度较快，步骤比胶体金试纸多，适合小样
本量测定免疫酶试剂盒国内无试剂 RT-PCR*病毒
基因 NY/T772—2004 速度较快，可以鉴定亚型。 RT-PCR 试剂盒农业部兽医诊断中心荧光 RT-PCR 病毒基因 GB/T19438.1-2004 （通用）;GB/T19438.2-2004（H5）GB/T19438.3-2004
禽流感诊断监测方法很多，各种方法都有各自的应用范围，有各自的优点和局限性。现将各
种方法作一总结，在诊断监测中，应根据具体需
要采用合适的方法。禽流感各种检测方法的比较
见下表。禽流感各种检测方法汇总表检测方法检测对象依据标准适用性与局限性所用试剂试剂
来源琼脂扩散（AGID）试验*A 型 AIV 抗体
AIV 抗体 NY/T770—2004 敏感性高，适合批量测定 ELISA 试剂盒 IDEXX 元亨免疫胶体金试纸 A 型
AIV 抗原适合现场快速诊断胶体金试纸条世纪元
亨免疫荧光（IF）试验组织、细胞病毒抗原诊断
笔也不像平常那般顺手。在这个异乡的海边，诸多回忆纷至沓来，如砂砾中的
速度较快，受主观经验影响大，不易掌握抗 AIV 荧光抗体国内无试剂免疫酶渗滤法 A 型 AIV 抗原
高敏感性，操作烦琐，易产生假阳性 NASBA 试剂盒上海出入境检验检疫局病毒分离 * 病毒
GB/T18936 可最终确诊，周期长鸡胚
1cd0f0ca1 EBET
笔也不像平常那般顺手。在这个异乡的海边，诸多回忆纷至沓来，如砂砾中的
GB/T18936 方法简单，敏感性低型抗原、抗血清
笔也不像平常那般顺手。在这个异乡的海边，诸多回忆纷至沓来，如砂砾中的
哈尔滨兽医研究所血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验*血凝素亚型抗原、抗体 GB/36 鉴定 HA

禽流感病毒的分离与鉴定技术

禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。

如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。

①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。

该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。

禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。

一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。

高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。

目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。

近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。

文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。

①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。

死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。

由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。

①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。

对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。

内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。

①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。

高致病性禽流感诊断技术

一、标准制定背景高致病性禽流感(HPAI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的。

在2005年至2021年期间，高致病性禽流感已导致全球3.16亿多只家禽死亡和扑杀，最多的年份是在2016，2020，2021年。

另外，在2006，2016，2017和2021年，这几年受到高致病性禽流感疫情影响的国家或地区超过50个。

此外，人偶尔也会感染禽流感病毒。

据WHO统计，人感染H5N1亚型约850例，其中约半数出现死亡；人感染H7N9约1500例，死亡约600例、感染H5N6病例约80例，死亡约30例，感染H9N2约75例，其中2例死亡，还有其他的H3N8，H7N4, H7N7和H10N8亚型感染人的报告。

这些数据表明，高致病性禽流感不仅会给养殖业造成严重的经济损失，还会给人类的生命安全带来威胁，因此要密切监测禽流感的动态以及发生发展趋势。

监测一个病原，离不开有效的诊断技术。

国际上禽流感诊断的依据是世界动物卫生组织出版的WOAH陆生动物法典和WOAH陆生动物诊断试验和疫苗标准手册，通常简称为陆生动物手册。

世界动物卫生组织OIE的缩写，今年5月份更改为WOAH。

陆生动物手册，每过一两年，都会根据病原的变化进行更新。

我国对禽流感诊断的依据有国家标准、行业标准等。

今天要和大家共同学习的《高致病性禽流感诊断技术》国家标准，第一版是在2003年制定的，标准起草单位是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

经过十几年的应用，伴随禽流感病毒不断遗传演化，伴随科技不断发展进步，新的诊断技术、诊断方法逐渐成熟，2003年出版的标准已经出现了滞后现象，对一些常用的，国际公认的检测方法，例如荧光RT-PCR检测方法，没有收录进来，因此，在2017年，我们提出了修订，该工作得到动卫中心全国动物卫生标准化技术委员会大力支持，并且在标准的征求意见阶段，得到大学、省市疫控部门、出入境检疫部门、大型养殖企业的大力帮助。

在此一并表示感谢。

在各位同行的帮助下，2020年末，《高致病性禽流感诊断技术》新版国家标准正式出版。

流感病毒分离标准操作规程

流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。

分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。

病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。

病毒分离亦受一定限制。

目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。

MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。

分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。

由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。

各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。

)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。

一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定

病毒，照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为Ａ／ｗａ／ａｇｏｇ１７２０。按ＳｎＧｕｎｄｎ／９／０４
关键词：流感；Ｈ５禽Ｎ１亚型；天鹅；离鉴定分
中图分类号：８２６９５￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０００ — ０５０１０ —０８２１）５００—４
动物医学进展。００３（）５８２１，１５：－
ＰｒｒｓｎＶｅｅｉａｙＭｅｃｎｅｏｇｅｓｉｔｒｎｒｄｉｉ
一
株天鹅源Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的分离鉴定
（南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室华广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，东广州５０４）广１６２
收稿日期：０９１－４２０ — １２基金项目：育部新世纪优秀人才支持计划项目（Ｅ－６０５）教育部创新团队项目（Ｔ７３；家肉鸡产业技术体教ＮＣＴ０ — ７２；Ｉｏ２）国Ｒ系项目（ｙｙｘ４－３０）广东省自然科学基金项目（４１６２１０１２；东省科技计划项目（Ｏ７ＯＯｏＯＩｎｃｔ－２Ｇ —３；８５０４００１３）广２ＯＡ２３Ｏ１）作者简介：煦灿（９３）男，东汕头人，士研究生，要从事动物病毒分子生物学及动物传染病防控研究。郑１８一，广硕主＊通讯作者：＃对本文有同等贡献作者

H1亚型禽流感病毒的分离鉴定

１材料与方法
１．１材料
１．１．１标准阳性血清抗Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ８、
流感大流行中均被证实是由Ｈ１亚型流感病毒或Ｈ３亚型流感病毒造成的。虽然目前没有证据能够充分证明这几次大流感的两种亚型病毒是来源于禽类，但可以推断出禽源的Ｈ１和Ｈ３亚型ＡＩＶ在为人类流感病毒的流行中提供了部分基因片段ｌ。
Ｈ１亚型禽流感病毒的分离鉴定
郭捷，谢芝勋，刘加波。，罗思思，庞耀珊，邓显文，谢志勤。，谢丽基。，范晴
（１。广西大学动物科学技术学院，广西南宁５３０００４；２．广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁５３０００１）
通过血凝试验（ＨＡ）、血凝抑制试验（ＨＩ）发现分离株只与Ｈ１亚型ＡＩＶ的血清反应，ＲＴ — ＰＣＲ鉴定其在４２２
ｂｐ处出现目的条带，进一步确定其为Ｈ１亚型ＡＩＶ。再根据鉴定后的毒株对鸡胚半数感染量（ＥＩＤ。）、鸡胚
半数致死量（ＥＩＤ。。）的测定与致病性试验，发现６株分离株均不会致ＳＰＦ鸡死亡，确定所分离的Ｈ１亚型
ＡＩＶ为低致病性禽流感病毒。关键词：Ｈｌ亚型禽流感病毒；分离；鉴定

一株肉仔鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定

深入开展炭疽杆菌分子生物学研究
Ｉ１１０
。
８７１肉鸡，早可发生于８最日龄，要表主现为突然减料，达１３１２饮水量可／ —／。下降，亡率较高，制不及时日死亡死控
气管、脏、脏等病料及血清采肺脾自聊城某发病肉鸡群：Ｐ鸡胚由梅里ＳＦ亚维通有限公司提供：验用８７仔实１肉鸡购自山东聊城莘县种鸡场：Ｄ、ＮＥＳ７标准阳性血清及标准抗原购Ｄ一６
５分子生物学研究近况炭疽杆菌是细菌学历史中发现和
Байду номын сангаас
２。该分离的Ｈ亚型禽流感病毒的鸡胚致死时间均在６之内，所采集血清进９９０ｈ对
行Ｈｌ测，检结果显示，Ｉ体水平明显高于未发病鸡群。Ｌ０２株病毒液静脉注Ｈ抗将Ｃ６６
酪样物质，脏出血，脏潮红肿胀。肺肾
通过鸡胚接种分离到一株病毒，对其
进行鉴定和致病性试验。
１材料与：－ｂ法１１材料、剂．试
备过程中易降解，获取质粒难度大有
关。目前，国外已开展了炭疽杆菌分子水平的研究，有关报道不详。们成但我功地构建了ｐＯ１质粒基因文库和建Ｘ立了ＤＡ针检测方法．有助于国内Ｎ探

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

中国畜牧兽医 2024,51(4):1642-1650C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析韩慧1,郭亚晶1,颜广智2,陈盛楠2,刘明杰2,莫美连2,黄良宗1(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院,佛山528000;2.广东方道基因生物科技有限公司,佛山528000)摘要:ʌ目的ɔ了解广东地区猪流感病毒(S w i n e i n f l u e n z a v i r u s ,S I V )的流行情况并探究其分子生物学特征㊂ʌ方法ɔ采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定㊁遗传进化和关键氨基酸位点分析㊂ʌ结果ɔ样品经实时荧光定量R T -P C R 检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1ʒ128;8个基因片段序列结果经B L A S T 比对和进化树分析显示,HA ㊁N A 基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H 1N 1)分支,P A ㊁P B 1㊁P B 2㊁N P 和M 基因属p d m /09分支,N S 基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)㊂关键氨基酸位点分析显示,分离株HA 蛋白裂解位点序列为P S I Q S R /G L ,具有典型低致病性流感病毒的分子特征㊂HA 基因在受体结合位点处的190㊁225㊁226位氨基酸分别为D ㊁E ㊁Q ,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能㊂N A 基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M 基因3处氨基酸位点突变为V 27A ㊁A 30T ㊁D 44A ,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加㊂ʌ结论ɔ本研究分离鉴定的毒株为G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征㊂本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据㊂关键词:欧亚类禽猪流感病毒;分离鉴定;序列分析;H 1N 1亚型中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.032 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-11-17基金项目:广东省自然科学基金项目(2017A 030310612)联系方式:韩慧,E -m a i l :1570387219@q q .c o m ㊂通信作者黄良宗,E -m a i l :l i a n g z o n g h u a n g@f o s u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dG e n e t i cE v o l u t i o nA n a l ys i s o f a E u r a s i a nA v i a n -l i k e S w i n e I n f l u e n z aV i r u sH A N H u i 1,G U O Y a j i n g 1,Y A N G u a n g z h i 2,C H E NS h e n gn a n 2,L I U M i n g j i e 2,MO M e i l i a n 2,HU A N GL i a n g z o n g1(1.S c h o o l o f L i f eS c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g ,F o s h a nU n i v e r s i t y ,Fo s h a n 528000,C h i n a ;2.G u a n g d o n g F i n d e r g e n eB i o t e c h n o l o g y C o .,L t d .,F o s h a n 528000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e e x pe r i m e n tw a s a i m e d t ou n d e r s t a n d t h e p r e v a l e n c e of S w i n e i n f l u e n z a v i r u s (S I V )i n G u a ng d o n g a n de x p l o r e i t sm o l e c u l a rb i o l o g i c a l ch a r a c t e ri s t i c s .ʌM e t h o d ɔN a s a l s w a ba n dl u n g t i s s u es a m p l e so f p i g ss u s pe c t e dt ob e i nf e c t e d w i t hS w i n e i n f l u e n z av i r u sw e r e c o l l e c t e d f r o ma p ig f a r m i nG u a n g d o n g f o r v i r u s i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ,g e n e t i c e v o l u t i o n a n d k e y a m i n o a c i d s i t e a n a l y s i s .ʌR e s u l t ɔTh e s a m pl e sw e r e t e s t e d p o s i t i v e f o rS w i n e i n f l u e n z av i r u s n u c l e i c a c i db y R e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P C R.I n t h e r e db l o o dc e l l a g gl u t i n a t i o n t e s t ,t h ev i r u s e x h i b i t e d a g g l u t i n a t i o nw i t h c h i c k e n r e db l o o d c e l l s ,w i t hah e m a g gl u t i n a t i o n t i t e r o f 1ʒ128.T h e r e s u l t s o f s e q u e n c i n g a n a l y s i so f e i g h t g e n es e g m e n t sw e r ea n a l y z e db y B L A S Tc o m pa r i s o na n d4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析c o n s t r u c t i o no fe v o l u t i o n a r y t r e e s,a nd HA a n d N A ge n e sb e l o n g e dt ot h eE u r a s i a na v i a n-l i k e S w i n e i nf l u e n z av i r u s(H1N1)b r a n c h,P A,P B1,P B2,N P a n d Mg e n e sb e l o n g e d t o th e p d m/09 b r a n c h,a n d N S g e n eb e l o n g e dt ot h e N o r t h A m e ri c a nt r i p l er e a s s o r t a n tb r a n c h,t h e r e f o r e,t h e i s o l a t e i n t h i s s t u d y b e l o n g e dt o t h eG4g e n o t y p eE u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n e i n f l u e n z av i r u s,a n d w a s n a m e dA/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1).K e y a m i n oa c i ds i t e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e c l e a v a g e s i t e s e q u e n c e o fH A p r o t e i no f t h e i s o l a t ew a sP S I Q S R/G L,w h i c hh a d t h em o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f a t y p i c a l l o w p a t h o g e n i c i t y i n f l u e n z a v i r u s.T h e a m i n o a c i d s a t p o s i t i o n190,225 a n d226o f t h e r e c e p t o rb i n d i n g s i t eo f HA g e n ew e r eD,Ea n dQ,r e s p e c t i v e l y,w h i c hs u g g e s t e d t h a t i t h a dt h e p o t e n t i a l a b i l i t y t ob i n dt ot h eh u m a ns a l i v a r y a c i dr e c e p t o ra n d i ta l s oh a dt h e p o t e n t i a l t ob i n da v i a ns i a l i ca c i dr e c e p t o r s.N o n eo f t h ea m i n oa c i dr e s i d u e so f N A g e n ew e r e m u t a t e d,s u g g e s t i n g t h a t t h e i s o l a t ew a s s e n s i t i v e t on e u r a m i n i d a s e i n h i b i t o r s s u c ha s o s e l t a m i v i r a n d z a n a m i v i r.H o w e v e r,t h em u t a t i o n s a t t h r e e a m i n o a c i d s i t e s i n M g e n ew e r eV27A,A30Ta n d D44A,s u g g e s t i n g a ni n c r e a s e dr e s i s t a n c et oa m a n t a d i n e-b a s e dd r u g s.ʌC o n c l u s i o nɔT h es t r a i n i s o l a t e da n di d e n t i f i e di nt h i ss t u d y w a sa G4E u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n ei n f l u e n z av i r u s.T h e a n a l y s i s o f k e y a m i n oa c i ds i t e ss u g g e s t e dt h a t t h i ss t r a i nh a dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f a d a p t i n g t o r e p l i c a t i o na n d e n h a n c i n g v i r u l e n c e i nm a m m a l s.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d yp r o v i d e d r e f e r e n c e d a t a f o r t h e p r e v e n t i o na n d c o n t r o l o f s w i n e i n f l u e n z a i nG u a n g d o n g.K e y w o r d s:E u r a s i a n a v i a n-l i k e S w i n ei n f l u e n z a v i r u s;i s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n;s e q u e n c e a n a l y s i s;H1N1s u b t y p e猪流感是由猪流感病毒(S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,S I V)引起的猪的一种急性呼吸道传染病,临床症状以咳嗽㊁流鼻涕㊁发热㊁食欲减退为主[1]㊂猪的呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6两种唾液酸(s i a l i c a c i d,S A)受体,能感染人流感病毒和禽流感病毒,不同流感病毒同时感染猪时极易发生基因重排而产生新的流行毒株,所以猪被认为是流感病毒发生基因重排的混合器 [2-3]㊂流感病毒的重排是产生具有新抗原性和生物学特性的子代病毒的主要机制,可导致流感灾难性的大流行㊂不同亚型S I V在世界范围内猪群中呈地区性流行,其中以H1N1亚型S I V最为常见㊂H1N1亚型S I V又可分为经典H1N1亚型(C l a s s i c a l s w i n e i n f l u e n z a v i r u s,C S H1N1S I V)和欧亚类禽H1N1亚型(E u r a s i a na v i a n-l i k e H1N1S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,E A H1N1S I V)等㊂E A H1N1亚型S I V于1979年在欧洲猪群中首次被报道,之后欧洲H1N1亚型S I V主体变成了E A H1N1亚型S I V[4]㊂中国E A H1N1分支于2001年首先报道于香港,随后在各地猪群中传播开来,分离率不断上升,目前已成为中国猪群中流行的优势毒株[5]㊂2009年,墨西哥暴发了席卷全球人群的甲型H1N1(P a n d e m i cH1N1 i n2009,p d m/09H1N1)流感病毒,成为21世纪第1次流感大流行,在全球范围内造成18000多人死亡[6]㊂大流行之后p d m/09H1N1毒株在人群中持续传播并传入猪群,p d m/09H1N1毒株在猪群中与E A H1N1亚型S I V等多种流行病毒发生基因重排,极大地危害了人类的公共健康[7]㊂2018年,猪群中E A H1N1亚型S I V与p d m/09H1N1亚型S I V等重排形成了多种基因型,其中G4基因型的重排方式是:HA和N A基因来自于E A H1N1亚型S I V,N S基因来自北美三源重排S I V,其余内部基因来自p d m/09H1N1亚型S I V[8-10],因此,这种G4基因型病毒对公共卫生构成更严重的威胁㊂目前,E A H1N1亚型S I V在中国南方的猪群中广泛传播,给人类健康带来严重威胁[11-12],因此,监测该地区S I V的流行和变异情况具有重要意义㊂2022年12月,在广东某猪场采集一批猪鼻拭子和肺脏组织样品,进行病毒分离鉴定,并对分离病毒进行全基因组基因测序和遗传进化分析,以了解分离病毒的起源及遗传进化特征,为广东省猪流感综合防控提供参考依据㊂1材料与方法1.1病料、S P F鸡胚病料为采集于广东省某猪场的猪肺脏组织和鼻拭子;9~10日龄S P F鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司㊂3461中国畜牧兽医51卷1.2主要试剂2ˑP h a n t aM a x M a s t e rM i x(D y eP l u s)㊁R N A 提取试剂盒(R N AI s o l a t e rT o t a lR N A E x t r a c t i o n R e a g e n t)㊁反转录试剂盒(H i S c r i p tⅡ1s tS t r a n d c D N AS y n t h e s i sK i t)㊁胶回收试剂盒(F a s t P u r eG e l D N A E x t r a c t i o n M i n iK i t)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;D L2000D N A M a r k e r购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.3病毒分离、鉴定及纯化将肺脏组织研磨液和鼻拭子液8000r/m i n离心5m i n,取上清过0.22μm滤膜除菌,接种于9~ 10日龄S P F鸡胚尿囊腔中,于37ħ恒温培养箱培养,去除24h内死亡鸡胚,72h后收集鸡胚尿囊液㊂按照上述方法将尿囊液再次接种鸡胚盲传2代,收集第3代尿囊液,通过S I V实时荧光定量R T-P C R 检测方法[13]和鸡红细胞凝集试验鉴定获得的病毒液,于-80ħ保存备用㊂鸡红细胞凝集试验是在V 形孔微量血凝板上将1%鸡红细胞与不同倍比稀释度的病毒反应,将血凝板倾斜70ʎ,观察沉淀于孔底的红细胞是否向下呈线状流动,以出现全部凝集(红细胞无流动)的最大稀释度为本分离株的血凝效价㊂1.4病毒全基因组扩增按照R N A提取试剂盒说明书提取病毒R N A,使用反转录通用引物(U n i12:5'-A G C A A A A G C A-G G-3')按照反转录试剂盒使用说明书进行反转录,合成c D N A㊂P C R引物参照H o f f m a n n等[14]建立的流感病毒全基因扩增方法合成,引物信息见表1㊂引物均由金唯智生物科技有限公司合成㊂根据高保真酶2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e P l u s)说明书分别扩增分离株的8个基因(P B1㊁P B2㊁P A㊁H A㊁N A㊁N P㊁M和N S基因)节段㊂P C R反应体系50μL:2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e p l u s)25μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各2μL,c D N A模板3μL,d d H2O补至50μL㊂P C R反应条件:95ħ预变性3m i n;95ħ变性15s,58ħ退火15s,72ħ延伸2m i n,共35个循环;72ħ延伸5m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定㊂扩增产物用胶回收试剂盒回收并送金唯智生物科技有限公司进行测序㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物大小P r o d u c t s i z e/b pP B2F:T A T T G G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T C G T T T2341 P B1F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G C A T T T2341 P A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A C T T2233 H A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T1778 N A F:T A T T G G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G A G T R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G A G T T T T T T1565 N P F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T A T T T T T1413 M F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G T A G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A G T T T T T1027 N S F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T8901.5病毒遗传进化分析测序结果通过S e q M a n软件拼接,N C B I网站在线B L A S T进行序列比对㊁相似性分析,通过N e t N G l y c1.0软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分析预测潜在糖基化位点,在G e n B a n k中下载参考序列,使用M e g a7.0基于N e i g h b o r-J o i n i n g方法构建遗传进化树,B o o t s t r a p值为1000㊂2结果2.1病毒分离鉴定经S I V实时荧光定量R T-P C R检测,鸡胚尿囊液样品C t值为20.88,判定为S I V核酸阳性(图1)㊂将收获的鸡胚尿囊液进行红细胞凝集试验,结果显示,有血凝性,血凝效价为1ʒ128㊂将分离得到的毒株命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022㊂2.2分离株全基因组测序通过R T-P C R对病毒的8个基因片段进行扩增,得到P B1㊁P B2㊁P A㊁HA㊁N A㊁N P㊁M和N S8个基因片段,大小分别为2341㊁2341㊁2233㊁1778㊁1565㊁1413㊁1027和890b p(图2),与预期目的条带大小相符㊂44614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析1,鸡胚尿囊液;2,阴性对照1,C h i c k e ne m b r y o a l l a n t o i c f l u i d ;2,N e g a t i v e c o n t r o l 图1 实时荧光定量R T -P C R 检测结果F i g.1 R e s u l t s o fR e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P CR M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1~8,P B 1㊁P B 2㊁P A ㊁HA ㊁N A ㊁N P ㊁M 和N S 基因M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1-8,P B 1,P B 2,P A ,HA ,N A ,N P ,M a n d N S g e n e s ,r e s p e c t i v e l y图2 分离株各基因片段P C R 扩增结果电泳图F i g .2 E l e c t r o p h o r e s i so fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so fe a c h g e n e f r a gm e n t o f t h e i s o l a t e 2.3 遗传进化分析2.3.1 病毒全基因组相似性分析分离株A/s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022的8个基因片段与G e n B a n k 登录的基因序列比对结果显示,HA ㊁N A ㊁P B 2㊁N P 和M 基因均与2018年在北京出现的A/s w i n e /B e i j i n g/0301/2018(H 1N 1)相似性最高,核苷酸相似性分别为97.94%㊁97.60%㊁97.27%㊁98.31%和98.83%,因此,进一步判定分离毒株属于H 1N 1亚型毒株,并将其命名为A /s w i n e/G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1);P A 基因与A /s w i n e /S h a n d o n g /L Y 142/2017(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为97.65%;N S 基因与A /s w i n e /L i a o n i n g /C Y 1833/2020(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为98.86%;P B 1基因与A /s w i n e /A n h u i /H D 21/2020(H 1N 1))核苷酸相似性最高,为96.92%㊂2.3.2 H A 氨基酸序列分析分离毒株A/s w i n e /G u a n g d o n g /C J M 2/2022(H 1N 1)HA 基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R /G L ,与近年来E AH 1N 1亚型S I V H A 裂解位点氨基酸组成相同,裂解位点仅含有1个碱性氨基酸(R ),具有低致病性流感病毒的特征㊂利用N e t N G l y c 1.0软件预测H A 蛋白潜在糖基化位点,结果显示,H A 蛋白具有5个潜在的糖基化位点,分别为26N S T D ㊁38N V T V ㊁288N C T T ㊁493N G T Y 和552N G S L ㊂2.3.3 N A 氨基酸序列分析分离毒株A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)N A 基因含有7个潜在糖基化位点,分别为44N Q S E ㊁58N N T W ㊁63N Q T Y ㊁68N V S N ㊁88N S S L ㊁146N G T V 和235N G S C,在58位多出1个潜在糖基化位点N N TW ㊂N A 蛋白氨基酸序列对神经氨酸酶抑制剂类药物如扎那米韦和奥司他韦的敏感位点119(E )㊁152(R )㊁275(H )㊁293(R )㊁295(N )的氨基酸残基均未发生突变㊂2.3.4 病毒表面基因遗传进化分析在N C B I 下载相关序列,通过M e g a 7.0分析软件,将分离株的HA 基因与G e n B a n k 中的C S H 1N 1㊁E AH 1N 1㊁类人型H 1N 1和p d m /09分支代表毒株进行比对分析并构建遗传进化树㊂结果显示,分离株的HA 基因位于E A H 1N 1进化分支(图3);由N A 基因进化树可看出,分离株的N A 基因也位于E A H 1N 1进化分支(图4)㊂5461中国畜牧兽医51卷图3 H A 基因进化树F i g .3 P h y l o ge n e t i c t r e e of H Ag e ne 图4 N A 基因进化树F i g .4 P h y l o ge n e t i c t r e e of N Ag e n e 64614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析2.3.5内部片段基因序列位点分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)序列进行关键氨基酸位点比对分析㊂P B2蛋白氨基酸位点进行比对发现,T271A㊁A590S和A591R的组合发生了突变㊂P B2蛋白中第431位氨基酸发生了T431M突变,第588位氨基酸发生了T588I突变㊂P B1蛋白的氨基酸位点H436Y发生替换㊂P A蛋白的P224S㊁L295P㊁A515T位点发生替换㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点发生替换㊂M蛋白的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生替换㊂N S蛋白关键氨基酸位点没有发生突变㊂2.3.6内部片段基因遗传进化分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)进行遗传进化分析,绘制进化树㊂分离株的P B2㊁P B1㊁P A㊁N P和M基因遗传进化分析结果显示,均来位于p d m/09H1N1分支㊂而N S基因处于北美三源重组分支(图5)㊂通过对分离毒株A/ s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1)的8个基因节段的序列分析发现,该毒株的HA和N A基因来源于E A H1N1分支,P B1㊁P B2㊁P A㊁N P和M基因来源于p d m09H1N1分支,N S基因来源于t r H1N2(N o r t hA m e r i c a n t r i p l e r e a s s o r t a n tH1N2)分支,这属于近几年流行的G4基因型E A H I N1 S I V㊂3讨论S I V可引起猪的高度传染性呼吸系统疾病,发病率高,传播速度快,使患病猪生产性能下降㊂此外,其对人类也有一定的感染性[15]㊂S I V的一个显著特性是通过不断的变异和进化来逃避宿主的免疫保护,从而引发新的流感暴发和流行㊂S I V的持续进化不仅改变了其毒力,还引发了更广泛的猪流感流行,严重威胁了公共卫生安全[16-17]㊂流感病毒H A蛋白受体结合区的特殊氨基酸位点是决定其宿主范围的关键因素,H1亚型流感病毒唾液酸受体结合能力一般取决于第190和225位氨基酸,分离株A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)中HA基因第190和225位氨基酸分别为D㊁E,第226位氨基酸为Q,表明其既具备结合S Aα-2,6-G a l型人流感病毒S A受体的特点,也有结合S Aα-2,3-G a l型禽流感病毒S A受体的可能[18]㊂A型流感病毒P B2蛋白上的627和701位点是影响病毒致病性的关键位点,如发生E627K或D701N突变会显著提高病毒毒力[19],本试验分离毒株未发现这两个位点的突变㊂本试验中,S I V P B2蛋白的T271A㊁A590S和A591R的组合发生突变,有研究表明,这有利于S I V在哺乳动物宿主中的复制效率和毒力[20]㊂P B2蛋白中单个氨基酸T431M 发生突变,该氨基酸的突变对于E A H1N1亚型S I V在小鼠体内的毒力中起着关键作用,会显著增强E A H1N1亚型S I V在小鼠中的毒力[21]㊂分离株的P B1蛋白氨基酸位点H436Y和P A蛋白P224S位点发生相同的突变,这2个位点的突变有助于增强病毒在小鼠身上的毒力[22]㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点突变,同样表明增强了对小鼠的致病性[23]㊂M基因的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生突变,提示分离株可能对金刚烷胺类药物耐药性增加[24]㊂G4基因型S I V自2016年以来在中国逐渐形成流行趋势,主要在猪群中传播[25]㊂该基因型毒株是来源于3种谱系的重排方式,包括E A H1N1㊁p d m/09H1N1病毒,以及综合了禽类㊁人类和猪的流感病毒基因的北美三源重组t r H1N2病毒,中国南方地区生态㊁地理和气候环境独特,猪场㊁鸡场密集及人和畜禽的频繁接触,有利于S I V的变异和流行[26]㊂分离毒株基因片段HA㊁N A与来自E A H1N1亚型S I V相似性较高,部分基因片段与p d m/09H1N1相似性较高,与北京㊁安徽㊁辽宁等省份的片段高度同源,提示分离株可能是在人流感病毒感染猪及生猪跨区域流动过程中重排产生㊂随着S I V的变异和与其他亚型病毒的重组,其跨种间传播的能力和感染人的风险也逐步增强㊂因此,加强对华南地区S I V的监测对公共卫生具有重要意义㊂对于养猪业来说,要采取有效的预防和控制措施,如定期消毒㊁加强饲养管理㊁提高猪群的免疫力等,以减少猪流感的发生和传播㊂74618461中国畜牧兽医51卷A~F,分别为P B1㊁P B2㊁P A㊁N P㊁M和N S基因A-F,P B1,P B2,P A,N P,M a n d N S g e n e s,r e s p e c t i v e l y图5内部片段基因进化树F i g.5P h y l o g e n e t i c t r e e o f i n t e r n a l f r a g m e n t s4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析4结论本研究分离到1株G4型欧亚类禽猪流感病毒(H1N1),将其命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)㊂HA基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R/G L具有低致病性流感病毒的分子特征,但在不同基因片段的关键氨基酸位点上发生了突变,这可能增强毒力和对哺乳动物的致病性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]黄良宗,颜广智,邓汝森,等.猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析[J].中国畜牧兽医,2020,47(8):2625-2633.HU A N GLZ,Y A N GZ,D E N G RS,e t a l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o na n d g e n e t i ce v o l u t i o na n a l y s i so fS w i n ei n f l u e n z av i r u sf r o m G u a n g d o n g p r o v i n c e[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2020,47(8):2625-2633.(i nC h i n e s e)[2]I T O T,C O U C E I R O J N,K E l M S,e t 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标准操作规程(SOP)——红细胞凝集抑制试验鉴定流感禽流感病毒方法

本SOP 是为了规范红细胞凝集抑制试验（HI ，hemagglutination inhibition test ）的操作规程，确保试验质量而制定。

二、范围适用于中国国家流感中心所有技术人员进行红细胞凝集抑制试验，鉴定流感/禽流感病毒。

三、程序（一）生物安全要求季节性流感病毒及经完全灭活的高致病禽流感病毒和H2N2流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，操作人员采取BSL-2级防护。

禽流感H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行，操作人员采取BSL-3级防护。

具体防护参见“流感中心生物安全个人防护SOP ”。

（二）材料1．流感病毒参比抗原及参比抗血清2．待检病毒3．1%红细胞悬液（鸡、豚鼠红细胞，由于“O ”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞）4．磷酸缓冲液（PBS ），0.01M ，pH 7.4 (Sigma P 3813)5．多道及单道可调加样器单通道可调加样器量程为 20μL ～200μL 、200μL ～1000μL8通道或12道可调加样器量程为 20μL ～200μL6．96孔微量板：鸡红细胞选择“V ”型或“U ”型底微量板；豚鼠红细胞选一、目的标准操作规程（SOP ）——试验鉴定流感/择“U”型底微量板。

7．其它耗材，200μL、1000μL滴头、试管、加样槽等。

（三）实验步骤1．试验前准备（1）PBS配制：按照Sigma的说明书的要求配制PBS缓冲液。

121℃高压灭菌20min，分装，4℃储存。

（2）1%红细胞悬液：按照“1%鸡红细胞悬液配制SOP、1%豚鼠红细胞悬液配制SOP”配制红细胞悬液。

（3）制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原1）一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。

进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25μL体积中含有4个红细胞凝集单位）的病毒量。

流感病毒的检测和监测技术的最新进展

流感病毒的检测和监测技术的最新进展
流感病毒的检测和监测技术一直以来都在不断发展和更新。

以下是一些最新的进展：1.病毒分离培养技术：这是病原学鉴定的金标准，对于采用常规PCR检测技术是
一个突破。

2.荧光实时定量PCR技术：这种新技术具有高灵敏性、高特异性和精确性等特点，
是病毒检测的重要手段。

3.监测系统：2005年，我国将全国流感、人禽流感监测整合一体，使全国监测
哨点的覆盖范围扩大到全部31个省、自治区、直辖市，并在5个计划单列市和各省
农村增设了监测哨点。

同时，建成了全国流感监测信息报告管理系统，实现了监测数据的实时、动态收集和监测结果的自动分析、反馈。

4.疫苗研发：全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，因此鸡胚分离培养在流感疫
苗研发中发挥着举足轻重的作用。

这些技术的进步为流感病毒的检测和监测提供了更为准确和高效的方法，有助于更好地防控流感的流行。

高致病性禽流感诊断技术规范

高致病性禽流感诊断技术规范高致病性禽流感（HPAI）是一种严重威胁家禽养殖业的病害，也对人类健康构成潜在威胁。

为了及早发现和防控HPAI，现有的诊断技术已经得到了不断改进和完善。

下面是一份针对HPAI的诊断技术规范，旨在确保准确、快速、有效地诊断和监测HPAI。

1. 采样方法：- 根据病情和流行程度，选择合适的样本收集方法。

常见的样本包括鸟类呼吸道分泌物、粪便和组织。

- 采样时应遵守生物安全规范，使用防护措施，以减少交叉感染的风险。

- 采集的样品应尽快送往实验室进行诊断。

2. 实验室设施：- 实验室应设有适当的生物安全级别，以确保操作人员和周围环境的安全。

- 实验室应配备足够的设备和试剂，以进行HPAI诊断所需的试验。

- 人员应接受相关培训，了解和遵守实验室操作、生物安全和废物处理规定。

3. 分子诊断方法：- 使用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或实时定量聚合酶链式反应（qPCR）等高灵敏度、高特异性的分子诊断方法，检测HPAI病毒的核酸。

- 确保PCR试剂和仪器的质量控制，并严格遵守反应体系的优化要求。

- 根据世界动物卫生组织（OIE）的指南，选择合适的引物和探针，以确保准确的HPAI病毒检测结果。

4. 血清学诊断方法：- 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或补体结合试验等血清学诊断方法，检测HPAI病毒抗体。

- 选择经验证和经批准的试剂盒和方法，确保有效的抗体检测。

- 根据病情和需要，采集血清样品进行抗体检测，并对结果进行正确解读和分析。

5. 其他诊断方法：- 根据病情需要，可以使用免疫组织化学染色、电镜等其他诊断方法进行辅助诊断。

- 选择合适的方法，根据样品类型和实验室设备能力进行决策。

6. 质量控制：- 实验室应参与质量控制和外部质量评估计划，确保诊断结果的准确性和可靠性。

- 定期进行试剂和仪器的性能验证和校准，及时更新和维护设备。

7. 结果报告和数据管理：- 诊断结果应及时报告给相关部门和组织，以采取必要的防控措施。

禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定

禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定李凤艳【摘要】对2013～2015年从各省养鸡场采集的口腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品,对其进行纯化得到4株H9亚型禽流感病毒,用针对H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段后进行测序分析,结果显示4个分离株经鉴定均为H9亚型禽流感病毒.对4个分离株的生物学特性进行研究,发现4株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】6页(P11-16)【关键词】H9亚型禽流感病毒;分离鉴定;生物学特性【作者】李凤艳【作者单位】辽宁益康生物股份有限公司,辽宁辽阳111000【正文语种】中文【中图分类】S858.28禽流行性感冒，简称禽流感（Avian lnflucnza，AI），是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）、流感病毒属、A型流感病毒所引起的一种禽类传染病，OIE根据对家禽所造成的疾病程度，禽流感被分为高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（lowlypathogenic avian influenza virus， LPAIV）。

H9亚型AIV属于LPAIV，是家禽中最常见的病毒之一。

H9N2亚型AIV最早于1966年从火鸡体内分离到[1]。

此后H9亚型的禽流感病毒也从许国国家的家禽和水禽中分离到[2]。

H9N2亚型AIV在我国广泛存在，且多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势[3]。

多数携带该病毒的野禽、水禽、家禽并不表现出临床症状或仅表现轻微临床症状，一旦出现临床症状多表现为呼吸系统症状、蛋鸡产蛋下降、肉鸡生长迟缓等，是影响我国养禽业发展的重要病原。

因此，关注H9N2亚型AIV的研究具有普遍的公共卫生意义。