禽流感病毒的分离与鉴定技术

孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样本密封后，放在加冰块的保温桶内，尽快送往实验室。①取9日龄～11日龄发育良好的SPF鸡胚，每个样本接种3枚～5枚，每枚尿囊腔内接种0.1mL，35℃～37℃条件下孵化3d～7d。收获前，鸡胚放在4℃条件下冷却4h或过夜。收获24h后死亡的鸡胚和活胚的尿囊液，3000r/min离心5min去除血细胞，进行血凝试验。①2禽流感病毒的初步鉴定①流感病毒颗粒表面的HA蛋白，具有识别并吸附于哺乳动物或禽类红细胞表面受体的结构，因此可以通过血凝试验进行检测。①HA试验是通过倍比稀释收获的鸡胚尿囊液

，加入等体积的一定稀释度的鸡红细胞，观察血凝情况。如果收取的尿囊液没有血凝价，继续盲传2代；如果有血凝活性，应通过血凝抑制试验确定分离的病毒。①证明尿囊液样本具有血凝活性后，还要进一步确定是哪些抗原在起作用。通常禽流感、禽副粘病毒（如ND）、禽腺病毒等都具有血凝活性，通过HI试验来鉴定，如果抗NDV等的血清能够抑制HA，证明有NDV存在[1]。①3禽流感病毒型的鉴定①流感病毒的核蛋白或基质蛋白具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为A、B、C3型。禽流感病毒属于A型。一般应用琼脂扩散试验（AGP）、免疫酶技术、免疫荧光抗体技术等来检测A型禽流感病毒。①3.1琼脂扩散试验①抗原可以采取感染鸡胚的尿囊液或尿囊膜。尿囊液可以通过超速离心或酸沉淀；尿囊膜用研磨器研磨后，冻融3次，1000g离心10min，取上清，经1mL/L甲醛37℃作用48h后，用作抗原。①琼脂扩散试验一般用0.01mol/L，pH7.2PBS配制9g/L琼脂，加入80g/LNaCl。琼脂板按7孔一组的梅花形打孔，中间1个，周围6个。用酒精灯轻烤平皿底部，封闭孔的底部。加样完毕后，静置5min～10min，翻面放置湿盒内，于37℃温箱培养24h～48h，可见沉淀线。被检抗原与阳性血清间出现沉淀线，并且该线和邻近的阳性抗原与血清间的沉淀线相连而不交叉，则该抗原被鉴定为A型禽流感病毒[2]。①3.2免疫酶检测技术①禽流感病毒型的检测还可以通过免疫酶技术进行检测，也称酶联免疫吸附试验（ELISA）。是用酶来标记抗原或抗体，通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法。分为直接ELISA和间接ELISA两种。目前已经商品化的A型禽流感病毒检测试剂盒（directigenfluAkit,bectondickinsonmicrobiologysystems,sparks,Md.）使用抗核蛋白的单克隆抗体，因此可以检测禽流感病毒。主要优点是可以在15min内检测出禽流感病毒，缺点是试验的敏感性受样本质量的影响很大。阴性结果并不表明未感染禽流感病毒，只能解释为未检出[3]。①3.3免疫荧光技术①免疫荧光技术(IF)即荧光抗体(fluoresentantibody，FA)技术，是鉴定和定位流感病毒感染细胞中特异性的抗原，主要是流感病毒的核蛋白(NP)或基质蛋白（MP抗原）。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光。①用于禽流感病毒的诊断，常用直接荧光抗体法，即在组织触(印)片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光。一种AIV的荧光抗体可以用来检测同亚型的其它病毒。荧光抗体技术用于诊断，具有快速、简便、敏感等特点，而且费用较低。需要注意的是，如何避免或降低标本中出现的假阳性问题(

非特异性荧光)。荧光抗体(FA)的敏感度同病毒分离相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。①间接免疫荧光技术也可以用来检测NP及MP抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解[4]。①FA技术同放射免疫测定技术(radioimunoassay，RIA)一样敏感，既没有放射性同位素的处理问题，也不需要液体闪烁计数器或γ计数器。①3.4放射免疫测定法①放射免疫测定法(RIA)是利用放射性同位素示踪技术的高灵敏性与免疫技术的特异性相结合的一种可定量分析测定方法。①标记中常用的放射性同位素是125I，以化学方法将其标记到抗原或抗体分子上。液相RIA要用液体闪烁仪或γ计数器来分析测定反应结果。固相RIA可与免疫沉淀或电泳技术相结合，通过放射自显影来分析结果。①可用125I标记的兔抗鸡IgG与禽流感抗血清及抗原进行反应测定(固相法)。可以进行抗原变异的分析(根据反应结合率)。因放射性同位素的污染问题，RIA正被ELISA等同样敏感技术所取代。①3.5核酸检测技术①以核酸探针(放射性标记或非放射标记)可以定位组织中参与病毒复制的感染细胞。由于核酸分子杂交具有很高的敏感性和特异性，用液相或固相杂交可进行诊断，检测病毒的核酸。①用同位素标记病毒的寡核苷酸片段进行垂直双向电泳，根据放射自显影的“指纹图谱”可分析不同毒株的核酸差异[5]。①4禽流感病毒亚型的鉴定①分离病毒被鉴定为A型禽流感病毒后，应进一步确定其H和N亚型。流感病毒有16个H亚型和9个N亚型，可以分别通过HI试验和NI试验来鉴定。①4.1HI试验①先要测定分离病毒的HA价，然后用4个HA单位的病毒与分型血清进行HI试验。使50%红细胞凝集抑制的最高稀释度作为判定终点。试验应注意抗原稀释液浓度必须为4HA单位，在每次使用前滴定并配制，应避免杂菌污染导致的非特异性结合。①4.2NI试验①NI试验比HI试验复杂得多，一般的诊断实验室不能完成，应由专门从事禽流感研究的禽流感参考实验室完成。目前已经用山羊制备了9个NA亚型中的8个亚型的抗血清，这些参照抗血清是用纯化的NA制备的，是特异的。参照抗血清是用来区分不同的NA亚型，但是在单独用某种NA亚型检测不同的毒株时，会出现广泛的交叉反应。需要注意的是HA的抗体可能对NA有封闭作用，从而得到错误的结果。①在NI试验中，血清中的抗体可以区分不同的NA亚型，抑制胎球蛋白底物上的病毒酶活性。每支被检流感病毒管中都加入了病毒样本和参照抗血清，将此结果与病毒对照组(病毒样本+PBS，未加抗血清)比较，被检病毒颜色锐减或无色的管则表明其

NA活性被这个亚型的参照抗血清抑制，每个被检病毒一定被一种NA亚型的抗血清抑制，据此，即可判断被检病毒样本的NA亚型。但是，有时在不同的NA亚型间出现交叉反应，此时要补充进行其他的实验，帮助确定判断结果。可以在抑制试验中提高抗血清的稀释度或用备用血清来解决这一问题，或者进一步通过NA基因测序来判断[6]。①5禽流感病毒致病力的判定①新分离的禽流感病毒还要进行毒力测定，可采用易感动物试验和血凝素裂解位点氨基酸序列测定来判定其毒力。根据OIE标准，以0.2mL（1∶10稀释）的无菌病毒感染尿囊液，接种8只4周龄～8周龄SPF易感鸡，隔离饲养，10d内导致6只或6只以上鸡只死亡的病毒为高致病性的禽流感病毒。即使没有达到上述75%死亡率标准，但是确定是H5或H7亚型，其血凝素的裂解位点存在一系列连续的碱性氨基酸，也视为高致病力禽流感。①静脉接种致病指数（intravenouspathogenicityindex,IVPI）也可用于判定毒力，采取以下的判定标准：由A型流感病毒引起的家禽的感染，其致病指数判定为：接种6周龄的SPF鸡，其IVPI大于1.2的，或血凝素的裂解位点处有一系列连续的碱性氨基酸存在的H5、H7亚型流感病毒，判定为高致病力病毒[2]。①6禽流感病毒的分子检测和鉴定①常规的病毒分离和检测技术是禽流感诊断的常用方法，但是这种方法需要时间较长，不能对高致病性禽流感做出迅速判断。反转录酶链式反应（RT-PCR）方法是一种快速诊断技术，可用于核酸的检测和亚型的鉴定。根据RT-PCR的原理和方法的不同，又分为常规PCR、套式PCR、多元PCR、荧光PCR等。目前常规PCR已成为鉴定禽流感病毒基因的一种重要技术，我国已制定了禽流感病毒通用荧光PCR，H5、H7及H9亚型禽流感病毒荧光PCR检测方法的国家标准。①6.1RT-PCR①RT-PCR方法是一种敏感特异的方法，即使在病毒基因组水平很低的时候，也可直接检出病毒的基因，灵敏度要高于ELISA，但应注意操作环境污染，造成结果假阳性。①RT-PCR方法的引物选择很重要，一般根据HA或NP基因设计A型流感病毒特异的引物，可根据是否扩增出PCR产物来进行病毒亚型的分型诊断。该方法目前应用较普遍，但应注意使用该方法检测气管样本的敏感性和特异性与病毒分离鉴定的相关性较好，而检测泄殖腔样本则敏感性较低[7]。①6.2套式RT-PCR①该方法是设计两对引物，一对引物扩增稍长片断，在这一扩增片断内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模板。有人认为该方法与病毒分离鉴定的敏感性相同，也有人认为它过于灵敏，易造成假阳性[8-9]。①6.3多元RT-PCR①一步法多元RT-PCR是指在一个PCR反

应体系中同时设立两对或两对以上引物，用于扩增不同的目的片断。这种方法可以同时检测流感病毒的型和亚型。具有快速、敏感性高的特点[10-11]。①6.4荧光RT-PCR①为了适应进出口活禽、禽肉制品中禽流感病毒快速检测的需要，建立了禽流感病毒荧光RT-PCR检测系统。禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒系列包括AIV通用型及H5、H7、H9亚型检测试剂盒。检验样本先用AIV通用型试剂盒检测是否含有禽流感病毒，对其中的初检阳性样本再用H5，H7，H9亚型试剂盒分型检测，也可直接进行H5，H7，H9的检测。①荧光PCR是20世纪90年代发展起来的一个新技术，它在PCR过程中利用荧光基因在光激发下释放的荧光量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析，以达到对原始核酸模板定量的目的。目前荧光PCR技术主要有Taqman探针技术和杂交双探针技术。与传统禽流感病毒鸡胚分离方法相比，荧光RT-PCR方法的优势非常明显，主要表现为快速、灵敏、特异、准确，另外该方法安全、应用范围广、取样及样本处理方便、不受疫苗免疫影响。①近年，SpackmanE等研究出一种一步法Real-timeRT-PCR荧光杂交探针，可以检测禽流感病毒并同时进行H5和H7亚型的鉴定。该方法与病毒分离方法具有很好的一致性，并且具有省时、费用低的特点[12]。①总之，对禽流感的诊断，实验室病毒的分离、鉴定以及致病性试验都耗时较长，费用也较高，分子生物学检测快速、敏感性高，这些诊断检测只有极少数的实验室能够进行。禽流感这类疫病的确诊越快、越早，损失就越小。当怀疑有禽流感发生时，应及时上报疫情，及时送到国家指定的实验室进行诊断是十分重要的。①