病毒的分离鉴定
〖医学〗流感病毒的分离鉴定
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤㈥ ㈦ ㈧ ㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不 管 是 中 医学 还是西 医学， 从二者 现有的 思维方 式的开 展趋势 来看， 均是走 向现代 系统论 思维， 中医药 学理论 与现代 科学体 系之间 具有系 统同型 性，属 于本质 相同而 描述表 达方式 不同的 两种科 学形式 。可望 在现代 系统论 思维上 实现交 融或统 一，成 为中西 医在新 的开展 水平上 实现交 融或统 一的支 撑点， 希冀籍 此能给 中医学 以至生 命科学 带来良 好的开 展机遇 ，进而 对医学 理论带 来新的 革命。 编 辑 本 段 现 代中医 史
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定随着时间的推移，社会和科技都在不断进步，但是人类和动物之间的生病依旧是一个有待克服的难题。
其中，非洲猪瘟病毒就是一个备受关注的话题。
非洲猪瘟是一种传染性疾病，其主要传播途径是经由活猪或者猪肉极易传染给正常健康的猪，导致肺气肿、肺炎、心包炎等严重疾病，可能导致猪的死亡。
因此，研究非洲猪瘟病毒的分离与鉴定方法是解决这个难题的关键。
非洲猪瘟病毒的分离是指将猪体内的病毒分离出来，而分离病毒的方法又可以分为直接分离和间接分离两种。
直接分离法：直接分离是通过将病猪组织或被病原体污染的器官肝、脾、淋巴结、肾、肺等组织或体液（血、脑脊液、呕吐物、粪便、眼泪等）移植于实验动物，如绵羊、狗、猴等，通过实验动物感染研究是否具有非洲猪瘟病毒的传染性。
由于直接分离是通过移植病原体与实验动物接触而进行的，因此这种方法不仅不能直接反映出病原体的真实性质，而且过程繁琐，操作复杂，不适用于大规模检测。
间接分离法：间接分离是通过特异性试剂检测经过滤处理的被污染样品，从样品中寻找病原体。
常见的间接分离方法包括RT-PCR、ELISA、免疫荧光法等。
其中RT-PCR是通过从猪血清、猪散污、淋巴液或组织中提取RNA，然后转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后检测特异性长度的DNA条带，确认是否为非洲猪瘟病毒。
该方法高灵敏、高特异性，可以在较短时间内获得精确的病原学检测结果。
除了分离非洲猪瘟病毒，病毒的鉴定同样需要一定的技术手段。
在鉴定非洲猪瘟病毒的过程中，最常用的手段是基因测序和分子生物学。
基因测序：基因测序可以识别和定位病毒基因组中的每一个功能基因和突变点，从而揭示病毒的演化和流行特征。
通过分析基因序列信息，确定病毒所含有的基因序列、编码蛋白质序列，从而比较不同品系之间或同一品系的病毒变异程度和遗传关系。
分子生物学：该方法主要是通过PCR技术进行检测，具有快速、灵敏、准确、特异等特点。
另外，该方法还可与特异性探针结合使用，提高标本中病毒的检测率，同时还可以通过PCR-RFLP技术检测病原体的分型，建立病毒分型数据库。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
病毒的分离鉴定
要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。
1.病毒的分离1.1标本的处理1。
1。
1标本的收集a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g,4°C离心6min.b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000X g4C离心30min。
c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液,3000X g4C离心30min。
1.1.2除菌处理a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4小时。
c）对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4°c过夜除菌.1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。
根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
1。
2。
1鸡胚接种a）鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致.b）孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行，气室向上，孵育的最适温度为38-—39C，相对湿度为40—70%,孵育8日后,鸡卵应每天翻动1-2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
c）检卵：鸡卵孵育4~5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。
②活鸡卵:鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。
③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。
肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法
肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法近年来，肺炎支原体感染成为全球范围内的公共卫生问题。
该病原体引起的肺炎病例逐年上升，对人类健康造成了严重威胁。
为了及时诊断和治疗肺炎支原体感染，科学家们开发了一系列有效的分离和鉴定方法。
本文将对肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法进行介绍。
一、流行病学调查在分离和鉴定肺炎支原体感染的病毒之前，进行流行病学调查是十分重要的。
通过调查病例发生的地点、时间、人群等信息，可以迅速锁定病原体分布的区域和特点，为下一步的分离和鉴定提供指导。
二、病毒分离病毒分离是检测肺炎支原体感染的基础步骤，常用的方法主要有以下几种：1. 细胞培养法：将临床标本中的病原体与合适的培养基和细胞共同培养，利用病原体在细胞内生长繁殖的特性，最终将病毒分离出来。
2. 动物接种法：将临床标本中的病原体接种到实验动物体内，观察其是否出现与肺炎支原体感染相类似的症状，通过实验动物的复制，最终得到病毒分离物。
三、病毒鉴定病毒分离后，需要进行鉴定以确认其是否为肺炎支原体感染的病毒。
常用的鉴定方法主要有以下几种：1. 免疫学方法：利用免疫学技术，如免疫荧光法、酶联免疫吸附试验等，对分离得到的病毒进行特异性检测和鉴定。
2. 分子生物学方法：利用PCR、实时荧光定量PCR等技术，通过分析病毒基因的特征序列，快速鉴定肺炎支原体感染的病毒。
四、抗体检测除了分离和鉴定病毒本身以外，通过检测患者体内产生的抗体，也可以对肺炎支原体感染进行诊断。
常用的抗体检测方法有血清学试验和免疫层析试验等。
五、药敏试验药敏试验可以评估肺炎支原体感染的病毒对不同抗生素的敏感性。
通过对分离的病毒进行不同抗生素的药物敏感性测试，可以指导临床医生开展合理的抗生素治疗。
六、实时监测和报告随着肺炎支原体感染的增加，实时监测和报告已成为防控的重要环节。
利用PCR等快速诊断技术，可将分离和鉴定的结果及时反馈给相关部门，以便及时采取防控措施，降低感染的传播风险。
病毒的分离与测定
第二十九讲病毒的分离与测定教学目的：掌握病毒效价的测定方法教学重点：噬斑法、终点法教学难点：病毒的分离与鉴定课时分布：1学时教学过程：一、病毒的分离与纯化1、病毒的分离病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。
（1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。
（2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。
噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。
2、病毒纯化通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。
（1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。
（2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。
二、病毒的测定在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。
发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数（1）电镜下直接计数（2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。
此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。
但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。
总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。
2、病毒的感染性测定测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。
病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。
病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。
病毒学- 病毒的检验汇总
可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对 其进行鉴定。但技术要求较高。 近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核 酸型鉴定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）
②脂溶性试验
用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理 者比较其TCID50的变化,以判断是否敏感。 乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病 毒的脂质包膜。 有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理 能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂 溶剂有抵抗力。因此,用乙醚等可以鉴定所分 离的病毒是否有包膜。
病毒粒的结构模式图
包膜子粒
包膜
包膜病毒
壳粒
衣壳
核衣壳
核心（核样物）
处理方法:
将病毒悬液2000~3000r/min离心20min,取上清液,分成 两组： 一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口 密封好,4℃过夜后,2000~3000r/min离心20min。此时液 体分为两层,上层为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分, 避免混有乙醚。 另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。 将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴 度明显降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感, 属于有膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说 明病毒对乙醚有抵抗力,属于无膜病毒。
(2)病毒的生物学特性 ①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合, 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。
鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定
动物生产 592023.6鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定于 柳（大连市金普新区动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116100） 鸭病毒性肝炎病毒是一种高致病性传染性疾病，其病程短、发病急、传播速度快、致死率高，临床症状为抽搐、痉挛、角弓反张等症状。
此病毒主要危害1月龄内的雏鸭，周龄越小死亡率越高，严重制约着养鸭业的发展。
本文对鸭病毒性肝炎病毒分离与鉴定方法进行综述，为此病的防控提供参考。
1 病毒分离与鉴定鸭病毒性肝炎病毒常用鉴定方法是分离培养病毒。
动物培养、细胞培养和鸭胚尿囊腔接种是3种病毒分离方法。
在细胞培养中，国外研究者报道此病毒可在鸭胚（鸡胚）肾细胞、鸭胚（鸡胚）成纤维细胞和鸭胚肝细胞中生长增殖。
鉴于不同毒株毒力强弱与对不同细胞适应性存在的差异，该病毒在细胞上会产生轻微病变或不发生细胞病变。
通常情况下，病毒初代分离使用鸭胚，连续传若干代之后易增殖。
死亡鸭胚的主要特征为皮肤水肿、出血、侏儒症、肝脏水肿呈绿色。
在传代中，病死率升高，死亡特征显著。
采集死胚尿囊液，采用中和试验和电镜技术等方法进行鉴定。
2 血清学方法2.1 中和试验检测鸭病毒性肝炎肝炎病毒最可靠、最经典的方法时中和试验。
此方法可在鸡胚、鸭胚、雏鸭进行固定血清—稀释病毒。
研究者发现，在56℃条件下，被检血清灭活半小时，将病毒与血清的混合液在接8日龄鸡胚前37℃水浴40分钟，检出率可明显提高。
2.2 间接血凝与血凝抑制试验间接血凝试验通过不断改进可用于检测血清中存在的各种病原抗体，与酶联免疫吸附测定相比，此方法操作简便、迅速、设备要求不高。
我国研究者将间接血凝抑制试验同中和试验进行比较，检测阳性结果符合率达85%。
2.3 乳胶凝集试验研究人员使用提纯浓缩的抗鸭病毒性肝炎病毒抗体致敏乳胶建立了快速检测抗原的反向乳胶凝集试验法。
结果显示，抗体致敏乳胶未出现自凝情况、特异性强、可重复，安全可靠。
并且，通过竞争凝集的原理，采用提纯浓缩的抗Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒抗体致敏乳胶结合待测血清抗体，建立了乳胶凝集试验检测法，此方法对抗原纯度要求不严格，避免鸭病毒性肝炎病毒难以纯化的情况。
病毒的分离与鉴定(一)ppt课件
7
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
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病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml. (4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果: 接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
实验九
1
病毒的分离与鉴定（一）
1、病毒的培养与鉴定 2、病毒的CPE过程 3、病毒的电镜照片观察 4、流感病毒的分离鉴定（一）
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内
接种
2
流感病毒的分离鉴定
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种 目的：熟悉人工培养病毒的常用方法及其操 作技术。
(+)
(—)
作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为
阴性时报告阴性
5
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室 界线,于胚胎附近无大 血管处画出标记作为 注射入口. (2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育. (5)每日在灯下检视鸡 胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
病毒分离鉴定
附件1 病毒分离鉴定采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。
通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等加入2扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。
37℃培养4872小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。
步骤如下1. 制备抗生素浓缩液青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL小瓶分装-20℃保存。
用时融化。
2. 取12g待检病料组织放入灭菌研钵中剪刀剪碎加入少量无菌生理盐水将其研磨匀浆再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养液制成20w/v组织悬液最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液混匀后室温作用1小时以1000g离心15分钟取上清液备用。
3. 用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层将所得细胞悬液以1000g离心10分钟再用一定量EMEM生长液含5胎牛血清无BVDV抗体56℃灭活30分钟、0.3谷氨酰胺、青霉素100I U/mL、链霉素100I U/mL悬浮使细胞浓度为2×106/mL。
4. 9份细胞悬液与1份上清液混合接种68支含细胞玻片的莱顿氏管leighton’s或其它适宜的细胞培养瓶每管0.2mL同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。
5. 经培养24、48、72小时分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物取出细胞玻片以磷酸缓冲盐水PBS液pH7.20.01M或生理盐水洗涤2次每次5分钟用冷丙酮分析纯固定10分钟晾干采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测见附件2。
6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度判定病毒在细胞中的增殖情况若荧光较弱或为阴性应按步骤4将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。
临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。
接种细胞时操作程序如下取-20℃冻存全血样品臵37℃水浴融化向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞37℃吸附2小时。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定病毒是一类微小的病原体，其特点是不能自主繁殖，必须寄生在宿主细胞内才能完成复制过程。
为了有效地控制和治疗病毒引起的疾病，研究人员需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离与鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离方法1. 细胞培养法：病毒通常寄生于宿主细胞内，通过培养宿主细胞，可以将病毒从样本中分离出来。
这种方法适用于许多病毒，如流感病毒、乙肝病毒等。
2. 动物接种法：某些病毒只能在特定宿主动物中复制，通过向实验动物接种疾病样本，可以使病毒复制并分离出来。
例如，用小鼠进行实验可以分离出小鼠肝炎病毒等。
3. 组织切片法：对于某些病毒，它们会引起组织的明显病变，此时可以取得感染组织的切片进行病毒分离。
例如，用患病动物的脑组织切片进行病毒分离，可用于研究狂犬病病毒等。
二、病毒的鉴定方法1. 电镜观察法：电子显微镜（TEM）可以观察到病毒的形态和结构特征，通过观察病毒的颗粒形状、大小、壳结构等特征，可以初步确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：根据病毒与宿主细胞之间的免疫反应，可以采用免疫学方法进行病毒鉴定。
包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，可以检测病毒的抗原或抗体存在。
3. 分子生物学方法：利用PCR（聚合酶链式反应）技术、序列分析等分子生物学方法，可以对病毒的基因组进行检测和鉴定。
这些方法对于那些无法用传统手段鉴定的病毒，如新型冠状病毒等，具有重要意义。
4. 勒芒氏法：这是一种用于病毒核酸的立体构建鉴定方法。
勒芒氏法根据病毒核酸在Denhardt液中染色的不同程度进行鉴定。
在进行病毒的分离与鉴定时，研究人员需要注意采取适当的实验室安全措施，避免交叉感染和意外暴露。
此外，病毒的分离与鉴定是一个复杂的科研过程，需要综合运用各种实验技术和方法，推动疾病防控工作的进展。
总结起来，病毒的分离与鉴定是关键的实验工作，它们为了研究病毒的性质、传播途径以及寻找有效的防治策略提供了基础性的支持。
病原体分离与鉴定实验技术
病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
一、细菌的分离与鉴定1. 样本采集与处理首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。
常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。
采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。
2. 培养与分离将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。
通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。
3. 形态学鉴定通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。
4. 生理生化鉴定细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。
5. 血清学鉴定血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。
该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血杆菌等。
二、病毒的分离与鉴定1. 细胞培养法病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。
将待测样本接种于合适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。
2. 核酸扩增技术核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。
通过PCR、实时荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进行病毒的鉴定。
3. 血清学检测病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。
通过血清学检测，可以检测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。
三、真菌与寄生虫的分离与鉴定1. 样本采集与处理对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。
2. 培养与分离将样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件控制，如温度、湿度等。
自然环境中常见病毒的分离与鉴定
自然环境中常见病毒的分离与鉴定随着科技的发展，人们对于自然环境中常见的病毒进行研究的需求也越来越高，因为一旦这些病毒被暴露出来并对人类造成危害，便会对社会和人类的健康带来重大的影响。
因此，对这些病毒进行分离和鉴定便成为了一项重要的研究工作。
一、病毒的分离如何将病毒从自然环境样品中分离出来是病毒学研究的一个难点，因为病毒具有很小的尺寸，同时活性和稳定性也很低。
常见的病毒分离方法包括通过细胞培养法、动物实验、PCR和免疫学检测等手段。
1、细胞培养法细胞培养法是常用的病毒分离方法之一，其原理是将携带病毒的样品接种到适合的细胞上培养，经过一段时间后，根据细胞死亡或出现病变的情况来判断是否存在病毒的感染。
但是，这种方法需要适宜的培养条件以及消耗很长时间，对于一些病毒来说不是很适用。
2、动物实验动物实验是比较可靠的病毒分离方法，其原理是将携带病毒的样品接种到动物体内，通过观察动物的症状、组织病变以及病原体分离和鉴定等指标来确认是否存在病毒感染。
然而，这种方法存在伦理和操作等方面的限制，不适用于所有病毒的分离。
3、 PCRPCR是一种用于扩增病毒DNA或RNA的技术，其原理是利用引物特异性酶切靶标DNA或RNA，通过不断进行反复循环来扩增病毒的核酸，从而达到病毒检测的目的。
但是，PCR技术存在一定的假阳性和假阴性的风险，需要注意检测结果的准确性。
4、免疫学检测免疫学检测是通过检测病毒的抗原或抗体来确认病毒是否存在的方法。
这种方法的优点是具有灵敏度高、速度快、成本低等特点，但是其针对病毒抗原或抗体的特异性要求也比较高，需要对病毒样品进行精确的处理和筛选。
二、病毒的鉴定病毒鉴定的目的是要对分离出来的病毒进行分类、鉴别和确定病毒株的特征，从而为病毒研究和疫苗设计提供依据。
常见的病毒鉴定方法包括电镜、免疫电镜、PCR、序列分析等。
1、电镜电镜是病毒鉴定的重要手段之一，其原理是利用高电压下加速电子的运动，从而通过对病毒粒子的形态和结构特征进行观察和比对，从而确定病毒属、种和型等分类信息。
病毒的分离培养鉴定和血清
④每孔加入1%鸡红细胞0.25ml，摇匀后置室温 30min、45min各观察一次结果，以45min的结 果为准(如果红细胞滑下，参考30min的结果)。
流感病毒血凝抑制试验(定量)
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理盐 水(ml) 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
病毒液 (ml)
0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃 0.5
病毒液 稀释度
1： 10
1： 20
1： 40
1： 80
1： 160
1： 320
②在U型孔有机玻璃板上选4个孔，按下表操作：
血凝抑制试验(定性法)
孔号（ml） 1
生理盐水 (ml)
血清(ml)
— 0.25
病毒液(ml) 0.25
1%鸡红细 0.25
胞(ml)
2 0.25 0.25 — 0.25
3 0.25 — 0.25 0.25
4 0.5 — — 0.25
说明：1号孔为试验孔，2号孔为血清对照孔， 3号孔为病毒对照孔，4号孔为红细胞对照 孔。将各孔内容摇匀，室温静置45min，待 红细胞完全下沉后观察结果。
5）拔出针头，用镊子将小胶布蘸取酒精烧灼 后封闭小孔，置于35~36℃温箱内培养，其 中翻动两次，用照蛋灯检视一次，36小时 后置-20℃冰箱20分钟后，无菌操作收获尿 囊液。
鸡 胚 的 检 卵
（二） 尿囊液的收获
1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒、酒精消毒气 室部位；
2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵 壳；
一株猪细小病毒的分离鉴定
摘要：2020年从黑龙江省某猪场的流产胎儿采集病料，经预处理后，接种猪肾原代细胞，能产生明显的致细胞病变作用。
经过血凝活性、病毒含量、荧光抗体检查、电镜观察、分子生物学等项测定，证明分离的病毒为猪细小病毒（PPV ）。
该病毒的HA 效价≥1:256，TCID 50≥107.0，呈PPV 特异性荧光，电镜观察到呈六角形或圆形、无囊膜、直径20nm 左右的病毒粒子，可以被PPV 特异性抗血清中和，PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条445bp 特异性电泳条带，并与7909株相符。
对其进行了VP2基因克隆和测序，序列分析表明，VP2基因片段与其它PPV 毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。
其与NADL-2株和China 株的亲缘关系最近。
毒株耐热，对胰蛋白酶有抵抗力，对乙醚、氯仿不敏感，pH 3～9，病毒稳定，该毒株纯净，无外源病毒污染。
本研究为该病疫苗的研发奠定了基础。
关键词：猪细小病毒；分离；鉴定一株猪细小病毒的分离鉴定孙心，梁宛楠*（哈药集团生物疫苗有限公司哈尔滨150040）doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.050收稿日期：2023-03-29作者简介：孙心（1977—），女，动物医学本科，主要从事动物疫病临床诊断与实验室检测，动物疫苗应用等工作。
E-mail:***************。
*通讯作者：梁宛楠（1987—），女，动物医学硕士，主要从事动物疫病临床诊断与实验室检测，动物疫苗应用等工作。
E-mail:139****************。
猪细小病毒感染是引起母猪繁殖障碍的原因之一，很早就被世界各国所证明[1,2]，1983年，我国在上海首次发现猪细小病毒感染，并进行了病毒的分离和鉴定[3]，后来侯世宽等[4]和李宝启等[5]也报道在吉林和黑龙江分离到猪细小病毒。
目前在我国已有较多猪场存在该病。
流感病毒的分离培养与鉴定
流感病毒的分离培养与鉴定一．实验目的1.掌握临床呼吸道病毒感染标本的采集、处理及送检原则。
2.掌握病毒滴度测定—红细胞凝集试验原理。
3.熟悉流感病毒的分离培养---鸡胚尿囊腔接种技术。
4.熟悉鸡胚尿囊液收集方法；红细胞凝集试验操作方法、结果观察及病毒滴度判定。
二．实验原理1.病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一,流感监测最主要的目的为:及时发现并抓住有意义的流感病毒新变种,尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报，因此,在流感诊断中任何方法都不能完全替代病毒分离这一方法，通常多用鸡胚来分离流感病毒。
2.3.血球凝集试验原理：某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集多种哺乳类动物和鸟类的红细胞,出现红细胞凝集现象，简称血凝现象。
这是由于流感病毒表面的血凝素是糖蛋白成分，红细胞表面有糖蛋白的受体,流感病毒血凝素结合在红细胞表面的糖蛋白受体上,从而发生红细胞凝集。
三．实验步骤1.标本采集→杀灭杂菌→接种→鉴定病毒类型2.培养：(1)取孵育10~12d鸡胚,在检卵灯下画出气室界线,于胚胎附近无大血管处画出标记作为注射入口。
(2)将卵置于卵架上,消毒标记处,用无菌剪刀尖在标记处打一小孔。
(3用灭菌注射器吸取流感病毒液0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射。
(4)注射后,用无菌胶布封孔,置35度温箱孵育。
(5)每日在灯下检视鸡胚情况(若鸡胚在接种后24h内死亡为非特异性死亡,应弃之)。
3.鉴定：(1)取小试管9支（或采用塑料凹孔板）,于第一管加入生理盐水0.9毫升,其余各管均加入0.25毫升。
(2)于第一管注入羊水或尿囊液0.1毫升，充分混匀,吸出0.75毫升,于第二管注入0.25毫升,其余0.25毫升弃入消毒液中(切不可乱弃）。
从第2管起对倍稀释至第8管。
(3)各管加入0.5%鸡RBC 0. 25m1，摇匀后室温静置60分钟。
30分、45分、60分各观察结果一次,以阴性对照红细胞沉积结果为准。
果树病毒病的病原体分离和鉴定
果树病毒病的病原体分离和鉴定果树病毒病是一种危害果树产量和品质的严重病害，其主要症状包括叶片发黄、萎缩、凋谢，果实畸形、变形、腐烂等。
为了防治果树病毒病，首先需要对其病原体进行分离和鉴定。
一、病原体分离病原体分离是通过分离植物体内的病原体，减少混杂杂质，从而方便进一步鉴定。
具体步骤如下：1. 病部样品的采集：选择病变程度较严重的部位，如叶片、茎和果实，用锋利无菌工具在病部表面刮取一定量的样品。
2. 样品的处理：将采集到的样品剪成小碎片，去掉显微镜下可见的杂质，将样品洗净去掉表面的脏物。
用双倍体芽孢杆菌涂覆样品上，避免细菌和真菌感染病原体。
3. 植物材料的共接：将处理好的植物材料共接于适宜的寄主植物，培养在适宜的温度和湿度条件下，等到出现新症状后再进行病原体分离。
4. 病原体的分离：从培养的病株上，割取病部组织并进行后续病原体鉴定。
二、病原体鉴定病原体鉴定是通过对分离的病原体进行形态、生理、生化、分子等特性分析，确定其种属、亚种和血统等信息。
具体步骤如下：1. 病原体形态学鉴定：观察病原体的大小、形状、颜色、纹理等形态学特征，进行初步分类。
2. 病原体生理学鉴定：针对病原体的生长速度、生长温度等生理特性，进行进一步分类。
3. 病原体生物化学鉴定：对病原体进行代谢物分析、酶促反应等实验，确定病原体的代谢途径和能力等信息。
4. 病原体分子鉴定：通过分子生物学技术，如PCR、基因测序等，对病原体核酸序列进行分析，确定其分子特征和亲缘关系。
综上所述，果树病毒病的病原体分离和鉴定是果树病害防治的重要手段之一。
对于果树病毒病防治工作而言，不仅需要对病原体进行分离和鉴定，还需要建立有效的防治措施，如生物防治、化学防治等。
只有在病原体分离鉴定的基础上，才能制定针对性的防治策略，为果树生产提供可靠的保障。
病毒的分离与鉴定.doc
病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。
1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。
所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。
细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。
原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。
原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。
因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。
二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。
二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。
二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，做为“种子”，供以后传代用。
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数据库的建设：汇集
了大量DNA序列、蛋白 质信息
预测基因、基因产物的
结构、功能；分析基因基因、基因-产物、产物-
产物之间的相互作用或
联系；描述细胞或整体 水平的基因表达谱；推
测系统发生关系。
•NCBI数据库
NCBI首先创建GenBank数据库
•于 1991 年 开 发 了 Entrez 数 据 库 检 索 系 统 ， 该 系 统 整 合 了 GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等数据库的序列信息 以及MEDLINE有关序列的文献信息，并通过相关链接，将他 们有机地结合在一起 •NCBI 还 提 供 了 其 他 数 据 库 ， 包 括 在 线 人 类 孟 德 尔 遗 传 (OMIM）、三维蛋白结构的分子模型数据库（MMDB）、人 类 基 因 序 列 集 成 （ UniGene ） 、 人 类 基 因 组 基 因 图 谱 （GMHG）、生物门类（Toxonomy） 等数据库
反转录合成cDNA
PCR扩增
直接测序或克隆测序
什么是聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K.
Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列 的相互作用。
Trans反转录酶系列
2．实时定量PCR
常用于mRNA的定量分析 实 时 定 量 PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是 定 量 分 析mRNA的最通用、最快速、 最简便的方法，该方法是对
SYBR Green PCR
2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定
结 晶 紫 染 色 中 性 红 染 色
（二）病毒理化性质及血清学鉴定
1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等
3）血清学鉴定 ELISA；IFA；
（三）病毒分子生物学鉴定
阳性分离物上清
提取总RNA
3.DNA芯片技术
基因芯片工作流程
DNA芯片（DNA chip）
在固相支持物上有序固化寡
核苷酸或DNA探针，与待测 荧光标记样品进行杂交；
通过对杂交信号的检测、比
较和分析，得出样品的遗传 信息(基因序列及表达)；
亦被称作DNA微阵列(DNA
microarray)。
三、生物信息学是预测基因组结构和功 能的重要手段
组织培养分离法： 没有隐性感染 没有免疫能力的抵抗力 接种量大 培养条件易于控制 加速病毒的分离过程 汉坦病毒敏感的培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等
细胞病变 （CPE ）：
1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变；
2、局灶状小颗粒 状破坏；
强调点：实验室生物安全
实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作； 在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作； 实验过程中一定要做好严格防护。
二、病毒的鉴定
（一）病毒的数量与感染性测定
1）蚀斑（plaque）测定 可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）
PCR操作过程
PCR技术的工作原理
1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA
完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟；
2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一
般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响；
3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸
一般在72 ℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩 增片段长短而定；
4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足
已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；
5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产
生非特异条带；
6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持
动物的发育、活动力、食欲和粪便 特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡 有些实验还需测量动物的体温和体重
•静脉接种
2．组织培养
（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养
（3）传代细胞培养
（4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变
“全程冷链”
1．动物接种
动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄） 优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离； 缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差 异；
接种途径：
•脑内接种 •皮下接种 •皮内接种 •腹腔接种 •肌肉接种
实验动物的观察：
常用分子生物学软件
引物设计- Primer Premier5.0
PCR扩增和序列测定
序列拼接DNAStar：SeqMan BLAST-序列比对确定病原 ClustalX -序列比对 BioEdit - 综合序列分析软件
MEGA5-系统发生分析
MegAlign-相似性分析 GeneDoc-序列差异分析、保守性分析
5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双 链。
PCR的各种变体
反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR）
1．反转录PCR
可用于mRNA的半定量分析 反 转 录 PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是 一种简单、快捷地对RNA进行定 性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增cDNA， 再以cDNA为模板进行特定基因转 录产物的PCR扩增。RT-PCR技术 一般用于RNA的定性分析；如果 设置阳性参照，则可对待测RNA 样品进行半定量分析。 该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。
3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。
圆缩； 脱落； 聚集； 破碎；
3．鸡胚培养
优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便； 缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；
4．蚊虫分离病毒法
经口感染
胸腔接种
优点：病毒可长时间保存在蚊体内；
蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大； 缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；
病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介
云南省地方病防治所 病毒立克次体病防治科 冯 云 E-mail:ynfy428@ 2012.5.30
一、病毒的分离
标本的处理
病毒的分离
蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒
实监测，具有
很高的灵敏度和特异性。
*目前有5种技术用于实时定量PCR
其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加； 其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的 需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是成本较高。