赤潮生物学

肽核酸探针
肽核酸（PNA） 是90年代初期人工 合成的DNA类似物， 是一类不带电荷， 具有类似于肽链骨 架结构并携带有碱 基的新信息分子
PNA的电中性 • 热稳定性
复合物 T m /℃ 复合物 T m /℃
15merPNA/DNA 15merDNA/DNA
69 54
15merRNA/RNA 15merDNA/RNA
4.荧光原位杂交
注：上图来自于侯建军的博士论文
5.荧光显微镜和流式细胞仪检测
应用该技术取得的相关结果 • 德国学者(John et al，2003）针对能够产生 spirolide毒素的亚历山大藻A．ostenfeldii与 产PSP毒素的亚历山大藻A．tamarens二种 亚历山大藻成功设计了特异性探针 • 唐祥海，于仁成等人通过设计特异性的寡 核苷酸探针，应用荧光原位杂交技术，实 现了对塔玛／链状亚历山大藻复合种亚洲 温带核糖体型的特异性标记和检测
操作步骤 藻种的选择和培养、DNA提取及PCR扩增 测序及序列分析 探针的设计及合成 荧光原位杂交（FISH）或膜杂交 荧光显微镜或流式细胞仪检测
应用该技术取得的相关结果 • 侯建军等人用阳性PNA探针与阴性PNA探针 和空白对照组相比，分别对单种T.pulchellum 进行标记，发现他们呈现出完全不同的荧光， 说明 • 侯建军等人利用设计的PNATP28S01探针均 能在混合样品中，将目标藻T.pulchellum识别 出来，而不会和其他藻发生显著的交叉反应
操作步骤 1. 藻种的选择和培养、DNA提取及PCR扩增 2. 测序及序列分析
3.探针的设计
Fig：探针AF 设计所针对的核糖体大亚基区域及其序列信息：其中序列AF是指相关亚历山大藻； 序列TA是指塔玛／链状亚历山大藻复合种的亚洲温带核糖体型；序列WE是指塔玛／链状亚历山大 ຫໍສະໝຸດ Baidu复合种的西欧核糖体型；序列PO是指微小亚历山大藻的葡萄牙核糖体型；序列NZ是指微小亚历 山大藻的新西兰核糖体型
寡核苷酸探针
原理：1、任何赤潮物种都存在着不同的 具有各自特异性的基因序列（如DNA或 RNA） 2、按照目标生物特征性靶序列的 差异可设计单链寡核苷酸探针，这种探针 具有高度的专一性和较强的稳定性。
目标序列的获取： 1. 核酸数据库或专门数据库 如：GeneBank、Genome Database、 RDP（核糖体数据库）等 2. 特异性引物扩增目的基因 如：核糖体RNA基因、蛋白特异性基因 3. 利用蛋白质或特异性氨基酸数据库 如：一些毒素合成酶基因
注：以上两图表引自何为主编的《肽核酸》
原理：LightUp探针和LightSpeed探针为 两种荧光标记的PNA探针。当未与靶序列 结合的时候，两者都不发荧光；与靶序列 发生结合的时候，其荧光基团暴露出来。 因此省去了杂交后除去游离探针的分离和 洗涤步骤。
PNA探针的种类及工作原理示意图
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分子检测技术概论
• 分子检测技术是以细胞表面或细胞内部的 生化标记(蛋白质、DNA、RNA)为作用对象 ,通过寡核苷酸、抗体、外源凝集素等标记 分子探针,检测全细胞或细胞匀浆中的专一 性标记结合物质,将标记转换为光信号,用于 目标赤潮生物的定性和定量分析。主要有 寡核苷酸探针、免疫探针、肽核酸探针 （PNA探针）及细胞凝集素探针（lectin探 针）
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条件：10mmol/L磷酸盐缓冲液，0.1mmol/LEDTA,100mmol/NaCl，pH值7.0
•
盐稳定性
NaCl/(mmol/L) 0 140 1000 Tm 15℃ PNA/DNA 72 72 65 Tm 15℃ DNA/DNA 38 56 65
条件：15merPNA/15merDNA与15mer互补DNA杂交；10mmol/L磷酸盐缓冲液pH值7.0
Contents
引言 分子检测技术概论 寡核苷酸探针 肽核酸探针
引言
• 有害赤潮的发生给全球造成了重大的经济 损失,对海洋生态环境、资源和公众健康构 成了严重威胁，正成为越来越严重的全球 性海洋灾害。
• 如何准确地进行赤潮监测,以便及时采取有 效防治和减灾措施,减少赤潮造成的危害和 损失。