离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸一、前言1、分离氨基酸的主要方法：(1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。
(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。
沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。
(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。
其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。
溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。
(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作离子交换柱层析在生物分离和纯化中广泛应用，包括蛋白质分离和纯化。
蛋白质通常具有带电的氨基酸残基，可以与柱子上的离子交换基团发生静电相互作用。
在离子交换柱层析中，通过调节溶液的pH值和离子浓度，可以控制蛋白质与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，从而实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。
1.离子交换柱的选择：根据所要分离的目标分子的特性选择合适的离子交换柱。
离子交换柱可以根据其固定相的性质分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，根据离子交换基团的类型分为疏水基团和孔隙基团等。
2.样品预处理：将待分离的样品进行预处理，包括清除杂质、富集目标分子等步骤，以获得较高的纯度和回收率。
3.样品加载：将预处理过的样品溶液加载到离子交换柱上。
样品溶液中的目标分子与离子交换基团之间发生静电相互作用，被柱子上的固定相吸附。
4.柱洗脱：通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度或盐浓度等条件，改变目标分子与离子交换基团之间的相互作用，使其从柱子上洗脱下来。
5.纯化目标分子：将洗脱得到的目标分子进一步纯化和收集，可以通过再次进行柱层析、凝胶过滤、电泳等方法进行。
离子交换柱层析操作对于蛋白质的纯化十分重要。
在蛋白质纯化中，可以根据蛋白质的等电点和溶液的pH值选择合适的离子交换柱，实现对特定蛋白质的选择性吸附和洗脱。
通过优化离子交换柱层析操作的条件，可以获得较高纯度和产量的蛋白质。
总结起来，离子交换柱层析操作是一种常用的用于生物分离和纯化的方法。
它利用样品中带电的离子与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，实现对生物分子的选择性吸附和洗脱。
离子交换柱层析对于蛋白质的纯化具有重要意义，可以通过调节柱层析条件实现对特定蛋白质的纯化和富集。
离子交换柱层析操作是一种非常有用和广泛应用的生物分离技术。
离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸【目的要求】1．学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理；2．掌握离子交换柱层析的基本操作；3．掌握氨基酸和茚三酮显色机理。
【实验原理】一、离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如错误！未找到引用源。
，错误！未找到引用源。
等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：或这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。
功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。
可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。
因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。
其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即可被分离。
带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。
离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。
氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。
在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
学习指南5 离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸——学习指南l 学习重点 1. 学习离子交换柱层析技术的基本原理和操作。
2. 掌握根据分离对象的性质差异进行实验条件的选择和设计。
l 知识要点1. 树脂：惰性的不溶高分子化合物。
根据树脂修饰的功能基团的性质差异，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂：功能基团是酸性的，其可解离的H ＋离子可与溶液相中的其它阳离子发生交换作用。
阴离子交换树脂：功能基团是碱性的，其可解离的OH －离子可与溶液相中的其它阴离子发生交换作用。
2. 离子交换柱层析法分离氨基酸：不同氨基酸的等电点不同，在同一缓冲液中，不同氨基酸所带电荷的性质和数量具有差异，与离子交换树脂的亲和力不同。
因此，不同的氨基酸会在洗脱的过程中先后流出层析柱，达到分离的目的。
3. 茚三酮法：在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成紫蓝色化合物（脯氨酸、羟脯氨酸反应生成黄色化合物），最大检测波长在570nm 处。
l 试剂 1. 阳离子交换树脂（Amberlite IR-120）。
2. 0.45mol/L pH5.3柠檬酸缓冲液。
3. 氨基酸样品：0.005mol/L 的Asp 和Lys （用0.02mol/L HCl 配制）。
4. 0.5%茚三酮溶液。
5. 0.1% CuSO 4溶液。
l 仪器层析柱、层析柱支架台、螺旋夹、恒流泵、旋涡混合仪、电磁炉、电磁炉锅、紫外可见分光光度计l 操作l 注意事项 1. 新鲜树脂通过预处理，可去除树脂生产过程中残留的溶剂、低聚物及少量的重金属离子等杂质。
2. 树脂预处理后的保存液与洗脱液不同，因此需预先平衡，以保证分离体系已经全部替换成洗脱液。
一般来说，需2~3倍柱床体积完成平衡。
3. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面，加入树脂的速度不能太快，以免产生气泡。
4. 加样时应避免冲坏树脂表面，注意不能将样品全部加在某一局限部位。
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理主要是基于它们在不同条件下的溶解性、酸碱性和极性的差异。
以下是常用的氨基酸分离方法：
1. 薄层层析法：将氨基酸溶液均匀涂布在薄层层析板上，通过上机进行高效层析分离。
根据氨基酸在固定相和流动相中的相互作用力的不同，氨基酸在薄层上的迁移距离也不同，从而实现分离。
2. 离子交换色谱法：利用带电的树脂固定相对氨基酸进行分离。
树脂可以选择正离子交换树脂或阴离子交换树脂，根据氨基酸的酸碱性质进行选择。
溶液中的氨基酸通过与固定相发生离子交换，从而实现分离。
3. 气相色谱法：利用气相色谱仪将氨基酸蒸发后送入色谱柱进行分离。
根据氨基酸在固定相和载气中的分配系数不同，氨基酸在色谱柱中的保留时间也不同，从而实现分离。
4. 高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将氨基酸在流动相中进行分离。
根据氨基酸与固定相之间的亲疏水性差异，通过调节流动相组成及流速，实现氨基酸的分离。
综上所述，氨基酸的分离原理主要是利用它们在不同条件下的物理化学性质的差异，通过各种色谱方法实现分离。
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离
实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离【原理】本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】1、树脂的处理关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
实验八离子交换色谱分离混合氨基酸（初稿）.doc
实验八离子交换层析离混合氨基酸一、目的要求1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。
2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
二、实验原理有些高分子物质含有一些可以解离的基团，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。
这类高分子物质统称离子交换剂，其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。
在pH=5.8条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在碱性条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
三、试剂与器材1、材料磺酸型阳离子交换树脂（732型）2、试剂树脂处理液：2mol/L NaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.10mol/L 柠檬酸缓冲液（pH=5.8）、0.01mol/L NaOH溶液、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。
0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮（或者---显色剂：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升）。
标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液。
混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按1：4比例混合。
3、器具离子交换层析柱（1.6X20cm）、量筒、吸管、收集器、试管及试管架、恒流泵。
四、操作方法1、新树脂的处理和转型干树脂用蒸馏水充分浸泡膨胀后，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCL和2mol/L NaOH依次浸洗搅拌30min，并分别用蒸馏水洗至中性（最后应处理至溶液无黄色）。
实训一 离子交换层析分离氨基酸.
实训一离子交换层析分离氨基酸目的要求1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作实验原理氨基酸是两性电解质，有一定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI 时带负电。
故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。
因而得到分离。
本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。
试剂和器材1．试剂（1）0.1N NaOH（2）氨基酸混合液：Gly、Asp、His各10mg溶于30m1 0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液中。
（3）0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液：取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中，再加入42ml 12N HCl 和6m1 80％苯酚(现用可不加苯酚)最终加蒸馏水至5000m1，用pH计凋溶液pH至 4.2。
（4）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10m1乙二醇溶解。
（5）Dowex 50的处理：Dowex 50用蒸馏水充分浸泡后，用6N HCl浸泡煮沸1h，然后用蒸馏水洗去HCl至树脂呈中性，换15％NaOH浸泡1h，用蒸馏水洗去NaOH至树脂pH呈中性，最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡备用。
2．器材（1）7220型分光光度计（2）层析柱(0.8×18cm)（3）试管操作方法1．装柱前准备用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。
2．装柱将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm时停止。
离子交换层析法分离氨基酸
3.平衡、加样
用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡交换柱。调节流速为 1mL/min，流出液达到床体积的2-3倍时即可上样。 由柱上端仔细加入氨基酸的混合液0.5mL，同时开始收集流 出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL柠檬酸 缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入 0.5mL缓冲液。如此重复两次，
各种氨基酸分子的等电点不同在同一ph时所带电荷不同与离子交换树脂的结合力有差异因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来达到分离的效果
实验三 离子交换层析法分离氨基酸
【实验目的】
（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 （2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。
【实验原理】
离子交换层析法主要是利用溶液中各种来自电离子与离子交苯乙烯磺酸钠型树脂（强酸1×8，100—200目）。 2mol/L盐酸溶液；2mol/L氢氧化钠溶液。 混合氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸溶液。 柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓 度0.45mol/L） 显色剂（茚三酮溶液）
12cm×1cm层析管; 蠕动泵; 部分收集器；烘箱。
【实验步骤】 1.树脂的处理 ：碱-酸-碱
H+或Na+
SO3—
—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—
有氢型和钠型
—CH —CH2—CH2—CH— 苯环—SO3— H+或Na+
从交换剂上洗脱目的物的方法有两种： 1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下 失去电荷甚至带相反电荷。
2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代 下来。
【试剂和器材】
4.洗脱
并将柱与蠕动泵想和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液， 每管收集1mL，共收集40—50管。
阳离子交换层析氨基酸洗脱顺序
阳离子交换层析氨基酸洗脱顺序阳离子交换层析是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于生物化学、分析化学和制药工业等领域。
在阳离子交换层析中，选择合适的洗脱顺序对于提高分离效果和纯化效率至关重要。
本文将以阳离子交换层析氨基酸洗脱顺序为标题，介绍不同氨基酸的洗脱顺序及其影响因素。
一、酸性氨基酸酸性氨基酸是指带有酸性官能团（如羧基）的氨基酸，例如谷氨酸、天冬氨酸等。
在阳离子交换层析中，酸性氨基酸往往是最先洗脱的。
这是因为酸性氨基酸的羧基可以与阴离子交换基团发生强烈的离子交换作用，使其从固相上解离下来。
二、中性氨基酸中性氨基酸是指既不带有酸性官能团也不带有碱性官能团的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等。
中性氨基酸的洗脱顺序相对较晚，需要较高的洗脱浓度或使用缓冲洗脱液来实现。
这是因为中性氨基酸对于阳离子交换基团的亲和力较小，相对难以从固相上解离下来。
三、碱性氨基酸碱性氨基酸是指带有碱性官能团（如氨基）的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸等。
在阳离子交换层析中，碱性氨基酸往往是最后洗脱的。
这是因为碱性氨基酸的氨基可以与阴离子交换基团发生较弱的离子交换作用，相对难以从固相上解离下来。
在阳离子交换层析中，氨基酸的洗脱顺序受多种因素的影响，包括溶剂pH值、洗脱缓冲液的浓度、洗脱温度等。
溶剂pH值是影响氨基酸洗脱顺序的关键因素，酸性氨基酸在酸性条件下更容易洗脱，碱性氨基酸在碱性条件下更容易洗脱，而中性氨基酸则对pH值的依赖性相对较小。
洗脱缓冲液的浓度也会影响氨基酸的洗脱顺序。
一般来说，洗脱缓冲液的浓度越高，洗脱效果越好。
但是过高的浓度可能会导致氨基酸结构的改变或其他副作用，因此需要根据具体情况选择合适的浓度。
洗脱温度对于氨基酸的洗脱顺序也有一定的影响。
在一定范围内，温度的升高会促进氨基酸与固相的解离，加快洗脱速度。
但是过高的温度可能会导致氨基酸的降解或其它副反应，因此需要在保证洗脱效果的前提下选择适当的温度。
阳离子交换层析氨基酸的洗脱顺序主要取决于氨基酸的性质以及实验条件的选择。
离子交换树脂层析分离混合氨基酸
离子交换树脂层析分离混合氨基酸
离子交换树脂是一种常用于层析分离混合氨基酸的工具。
它的原理是通过树脂的化学特性来吸附和分离氨基酸。
下面将该过程分为四个部分进行介绍。
1. 树脂的选择和预处理：
离子交换树脂有阴离子和阳离子两种类型，选择适合的树脂取决于目标分离物的电荷。
一般来说，可以使用阴离子树脂分离带负电性质的氨基酸，使用阳离子树脂分离带正电性质的氨基酸。
在实际操作中，需要对树脂进行预处理，以去除杂质和平衡其交换容量。
2. 样品处理：
混合氨基酸需要在适宜的pH下带电，使其可以被树脂吸附。
这可以通过溶液的pH值调节来实现。
同时，样品中还可能存在其他有机物或盐类等杂质，需要进行适当的处理，以免影响分离效果。
3. 树脂的吸附和洗脱：
在加入样品后，树脂将吸附带有相反电荷的氨基酸。
随后可以通过洗脱液使吸附的物质从树脂上释放下来。
洗脱液的选择取决于目标分离物的电荷和亲和性。
通常情况下，可以使用适当的缓冲液实现洗脱。
4. 纯化和检测：
洗脱得到的溶液可以进行进一步的纯化和检测。
常见的方法包括薄层
色谱、高效液相色谱和质谱分析等。
通过离子交换树脂层析分离混合氨基酸，可以得到单一氨基酸的纯品。
这种方法在生物技术、药物制造等领域中得到广泛应用，并且为其他
分离和纯化过程提供了重要的基础。
离子交换分离氨基酸实验报告数据处理
离子交换分离氨基酸实验报告数据处理
离子交换分离氨基酸实验的数据处理一般包括如下步骤：
1.氨基酸产率计算
氨基酸产率 = 氨基酸分离后质量 / 氨基酸分离前质量
其中,氨基酸分离后质量为经过离子交换分离后的氨基酸质量,氨基酸分离前质量为未经过离子交换分离的氨基酸质量。
2.氨基酸纯度计算
氨基酸纯度 = 氨基酸的质量 / 氨基酸和杂质的总质量
其中,氨基酸的质量为离子交换分离后得到的纯氨基酸的质量,氨基酸和杂质的总质量为离子交换分离前混合液的质量。
3.离子交换效率计算
离子交换效率 = 采集到纯氨基酸的质量 / 初始投加的氨基酸总量
其中,采集到纯氨基酸的质量为通过离子交换分离得到的纯氨基酸的质量,初始投加的氨基酸总量为在离子交换分离前加入离子交换树脂的氨基酸总量。
通过以上计算,可以得到实验的结果,从而应用到实际生产或研究中。
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离子交换柱交换层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸
一、实验原理
离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。
树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。
由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。
从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。
带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。
本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。
在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。
将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。
二、实验器材
实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、
0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用
0.02mol/L的HCl配制）
三、实验操作记录
1、树脂的处理
干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。
再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。
2、装柱前的准备
选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。
将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。
3、装柱
向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。
倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。
待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。
装柱要求连续，均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。
4、平衡
层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。
5、加样
关闭恒流泵，关闭层析柱底端出口，移去层析柱上端出口塞，缓慢打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时，立即关闭出口。
用移液枪吸取0.5mL样品液沿柱内壁缓慢加入柱中，以免冲坏树脂表面。
加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面降至与树脂表面相平处关闭。
吸取少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至液层3~4cm左右，接上恒流泵。
加样时应注意避免冲破树脂表面，避免将样品全部加在某一局限部位。
6、洗脱
以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速24mL/h，每管4mL，10min一管（试管收集前提前编号）。
7、测定
分别取各管洗脱液1mL，各加入茚三酮显色剂1mL，混合后沸水浴5min，冷却，各加0.1%CuSO4溶液3mL,混匀，测定。
以吸光度值为纵坐标，洗脱液累计体积（每管4mL，故4mL为一个单位）为横坐标绘制洗脱曲线。
四、实验结果
1、吸光度测定结果
0 1 2 3 4 5 6
试剂
/mL
样液—— 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
缓冲液 1.0 ————————————
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5%茚
三酮
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
0.1%Cu
SO4
0.000 0.015 0.439 0.885 0.041 0.089 0.090 试剂
7 8 9 10 11 12 13
/mL
样液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
缓冲液——————————————
0.5%茚
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
三酮
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
0.1%Cu
SO4
0.101 0.104 0.084 0.138 0.111 0.122 0.094 2、洗脱曲线
按要求绘制洗脱曲线得：
五、分析与讨论
1、由洗脱曲线可大致看出由两个洗脱峰：
第一个峰出现在约12mL时，这个峰形状较明显，峰窄而高，上升和降落都较为陡峭,判断应为Asp的洗脱峰。
因为Asp的pI为2.97，pH5.3时Asp带负电荷受阳离子交换树脂的磺酸基团排斥下，优先洗脱出来。
由于受到静电排斥力的作用，Asp的洗脱较快且较为集中，故峰形状窄而高。
第二个峰出现在约40mL时，这个峰较为平坦，难以区分。
从洗脱曲线可以看出，从20到52mL，吸光度的变化不大，且在48mL处还出现了小起伏，很难判断峰出现在何处。
第二个峰应为Lys的洗脱峰，Lys的pI为9.74，pH为5.3时Lys带正电荷，与树脂的磺酸基团亲和力较高，故在通过树脂时，会被树脂吸附。
之后在洗脱液的冲洗下逐渐与树脂脱离从而洗脱出来。
推测：因为促使Lys洗脱的只有重力和洗脱液的冲击，而不像Asp那样有静电斥力，所以洗脱较为缓慢，所以峰平坦而不明显，且持续较长时间。
2、本次实验中出峰较晚，第一个峰出现在第三管（其他同学大多出在第二管），且一直收集到第13管都没有观察到吸光度明显下降。
说明这次装柱时柱层过长，影响了实验进度。
3、实验改进：在第一个峰基本消失后，可以改用高盐缓冲液洗脱，使吸附在树脂上的Lys尽快洗脱下来，也许第二个峰会更明显。