无菌作业指导书(新)

作业指导书

无菌试验

操作细则

编号- -2006

版本号第一版

生效日期

起草

审核

批准

一范围：

适用于本规程规定的医疗用品的无菌试验方法。无菌检查法系用于检查要求无菌

的医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检

查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

本试验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真

菌污染。

二依据：

GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法。第二部份：生物试验方

法。

中华人民共和国药典2005年版二部

三器具及试剂

3.1.器材

3.1.1 仪器

超净工作台光学显微镜恒温培养箱生化培养箱压力蒸汽灭菌器

3.1.2 用具

试管注射器量筒三角烧瓶锥形瓶移液管灭菌刻度吸管（1ml）灭菌平皿（9cm）酒精灯75℅乙醇棉灭菌的剪刀和镊子精密PH试纸灭菌袋或牛皮纸

3.2培养基及制备方法

硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养; 改良马丁培养基置20～25℃培养。

培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用。

A).硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养需气菌、厌气菌）

酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g

L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml 硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.5～0.7g (或硫乙醇酸0.3ml) 蒸馏水1000ml

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入蒸馏水中混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的颜色不得超过培养基深度的1/3，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

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B).改良马丁培养基（用于培养真菌）

蛋白胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 蒸馏水1000ml

除葡萄糖外，取上述成分加入蒸馏水内混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。

C）.营养琼脂培养基

蛋白胨10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉3g 15～20g琼脂蒸馏水1000ml

取上述成份混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

3.3 稀释液、冲洗液及其制备方法

1、质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液

2、0.1％蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH

值至7.1±0.2，分装，灭菌。

3、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠

4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

4.1 实验前准备：

4.1.1培养基要求：

用于培养需（厌）气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其他各项要求应符合《中国药典（二部）》附录中《无菌检查法》的规定。

培养基可按药典的处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。制备后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃、避光的环境。

培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用;若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

4.1.2器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸气灭菌器内

121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。

4.1.3无菌室要求：无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在30℃～35℃培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好，置30℃～35℃培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落数平均不得超过1个.

无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开平皿盖，至试验结束盖好照上法培养，应符合上述要求。

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4.1.1.5阳性对照：应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的

供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希氏菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白

色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查（大

肠埃希氏的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌）加

菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品

量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。

5、检验步骤

5.1供试品数量：同一批号至少7--21个单位供试品,其中10管细菌，10管毒菌，1管细

菌阳性对照品。（金黄色葡萄球菌）

注1每种培养基各接种10支供试品。

2桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。

3如果医用器械体积过大，培养基乃是可在2000ml以上，将其完全浸没。

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