实验一质粒DNA的小量制备
质粒小提步骤
质粒小提（AxyPrep质粒DNA小量试剂盒）本试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。
适合从1-4ml细菌培养物中提取多至20ug高纯度的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性Rnase A:50mg/ml,室温可贮存6个月，长期贮存于-20℃。
Buffer S1：细菌悬浮液。
加入Rnase A后，混合均匀，4℃贮存。
Buffer S2：细菌裂解液（含SDS/NaOH），室温密闭贮存。
Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。
使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（可用100%乙醇或95%乙醇）。
混合均匀，室温密闭贮存。
Eluent：洗涤液，室温密闭贮存。
二、注意事项Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。
若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
三、实验准备1、第一次使用前，Rnase A全部加入Buffer S1中，4℃贮存。
2、准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
3、第一次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇。
4、使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，应于37℃温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。
四、操作步骤1、取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12000*g离心1min，弃尽上清。
2、加250ul Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
*确认Buffer S1中已加入Rnase A3、加250ul Buffer S2，温和并充分的上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。
质粒小量提取
质粒DNA的小量制备
方法
1.接种一个质粒菌落到5ml LB（含相关抗生素）培养液中,37℃摇床生长至饱和状态（过夜）。
2.取1.5m1菌液高速离心20秒 (或6000转/分)。
3.垂悬沉淀在1O0ul GTE溶液中，室温5分钟。
4.加2O0ul NaOH/SDS溶液，混匀置冰浴5分钟。
5.加3M KAC或3M NaAc l5Oul，旋涡混匀，置冰上5分钟。
6.高速离心3分钟，转移0.4m1上清到另一微型离心管中，加0.8m195%乙醇或无水乙醇或0.6倍体积异丙醇，置室温15~20分钟。
7.高速离心3分钟，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次高速离心弃上清，沉淀置37℃孵箱使乙醇挥发。
8.每管加30ul TE或SDW溶解沉淀后，封口，或加RNaseA消化RNA后再纯化，置-20℃备用。
9．用1%的琼脂糖凝胶电泳提取液，于凝胶成像系统观察结果。
生物技术制药试验
生物技术制药实验武汉大学药学院生物技术实验室湖北·武汉目录实验一质粒DNA的小量制备 (2)实验二质粒DNA电泳鉴定 (4)实验三感受态细胞的制备和转化 (5)实验四目的基因的表达及表达产物的初步提取 (8)实验五蛋白质纯化—盐析沉淀法 (10)实验六凝胶过滤层析 (14)实验七蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） (16)实验八HRP结合物的过碘酸钠交联法 (19)实验一质粒DNA的小量制备【目的】学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
【原理】根据共价闭合环状质粒DNA和线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。
【器材】超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
【试剂】pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10μg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液（溶液II），KAc溶液（pH4.8）（溶液III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
【实验准备】1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20︒C保存）。
2. 配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121︒C灭菌20min）。
3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
内蒙古大学基因工程大实验思考题
内蒙古大学基因工程大实验思考题本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
二、质粒DNA电泳鉴定1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。
这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。
通常观察到的是超螺旋和环状质粒。
2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3.影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。
三、质粒DNA的酶切1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。
2.如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。
3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。
四、PCR扩增制备目的基因1.复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。
质粒
1.3.3 凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水 平胶框或垂直胶膜，插入梳子,自然冷却。
1.1.3 琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检 测及定量测定
1.1.4 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干 膜可长期保存
.
1.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳
核酸相对分子量质量及分子构型 凝胶的浓度
1.2.1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对 的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大 小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁 移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时， 分子大小不宜超过此值。
载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制 与表达的质粒(运载工具)。
具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。
载体的结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
1.4 结果分析
1.4 结果分析
1.DNA 相对分子量标准物（marker); 2.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 完全酶切； 3.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 部分酶切； 4.自提pUC19 质粒 DNA （此效果提得较好，为1带，以超螺旋质粒DNA 为主。有时是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时 结果为2条带）
[整理版]实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳
![[整理版]实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳](https://img.taocdn.com/s3/m/13f260e7f605cc1755270722192e453610665b6a.png)
实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能，进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。
同时，掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。
二、实验原理利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。
DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。
DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。
DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光。
但需注意EB是一种强诱变剂！三、实验材料、仪器与试剂（一）、实验材料含有质粒pBS的DH5α菌株（二）、实验仪器微量移液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统，紫外投射仪等。
（三）、实验试剂与配制1、小量质粒DNA提取试剂盒2、LB液体培养基: 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl10g, 用NaOH调至pH7.2-7.5。
高压下蒸汽灭菌20分钟。
3、LB固体培养基：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
4、氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 ℃下保存备用。
质粒DNA的提取
得到的 SDS的作用是:质溶解粒细胞D膜N和A核膜用, 并T使E蛋液白变（性 含Rnase A ）溶解，消化RNA即得不含RNA
的质粒DNA，用于酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定。
注意事项
❖ 1.高速离心机使用相关注意事项； ❖ 2. 加入溶液I后要使菌体完全重悬； ❖ 3.加入溶液II和溶液III后，温和上下颠倒混匀
实质溶验粒题 D液N目A—的I—纯I当化次常（实用验碱S裂D解S法,、其中EDNTAa、OSHD)S、2酚0的0作u用L分别轻是什柔么？颠倒混匀
注意分层的有机相和水相； 酚的作用是: 变性沉淀蛋白,抑制DNase的活性 实验报告按下列要求书写
高溶速离液心机I使I用I相（关注乙意事酸项；钾、冰乙酸) 150uL,颠倒混匀,冰浴5min
0,50mol/L葡萄糖，25mmol/LTriห้องสมุดไป่ตู้-HCL，10mmol/L1EDTA ) 无水乙醇作用: (在有盐的条件下)沉淀核酸
学加1习入0用 等0碱体0裂积0解苯r的酚p方/m氯法仿离从/异大心戊肠醇杆1混菌0合中m液小i量n提，取质弃粒D上NA的清方法，和原沉理。淀加入70%乙醇1mL 10000rpm离心 5min，弃上清，沉淀干燥 无水乙醇作用: (在有盐的条件下)沉淀核酸
质粒DNA的提取和纯化步骤
❖ 收集细菌 ❖ 使菌体裂解 ❖ 分离出质粒 ❖ 进一步纯化
操作步骤 p163
I （ p H 8 . 0 , 5 0 m o l / L 葡 萄 糖 ， 2 5 m m o l / LTr i s - H C L ， 10mmol/L1EDTA ) （pH12.6, 1% SDS , 0.2mol/L NaOH) （pH4.8,5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml) :25:24:1
实验一`植物DNA的提取及凝胶电泳分析
实验一、植物DNA的提取及凝胶电泳分析一、植物DNA的提取原理利用基因组DNA较长的特性，可以将其于细胞器或质粒等小分子DNA分离。
当加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离提取的目的。
分离基因组DNA应尽量在温和的条件下操作。
二、实验试剂CTAB 氯仿乙戊醇乙醇异丙醇酚NaAc Tris碱EDTA RnaseANaCl等三、操作步骤（一）简易提取1.在50ml带盖离心管（放在-20度预冷）中加入20ml提取缓冲液I，60℃水浴预热。
2.水稻幼苗或叶子5~10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30~60分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。
3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静止5~10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。
4.室温下5000rpm离心5分钟。
5.仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6.在1.5ml eppendorf 管中加入1ml TE。
用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。
7.如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。
这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。
9.加入5μlRNaseA（10μg/μl）,37℃10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10.加入1/10体积的3mol/L NaAc 及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。
质 粒 提 取 原理及步骤
Ｆoｒpersoｎal ｕse only ｉn stｕdy a ｎd rｅsｅarch; ｎot fｏｒmｅｒciaｌuse质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒ＤNＡ，这些方法都含有以下3个步骤：１、细菌培养物得生长。
２、细菌得收获与裂解3、质粒DＮA得纯化.（一）细菌培养物得生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素得液体培养基中生长）,然后从中纯化质粒，质粒得提纯几乎总就是如此.现在使用得许多质粒载体(如pUＣ系列）都能复制到很高得拷贝数,惟致只要将培养物放在标准ＬB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DＮＡ.然而，较长一代得载体（如ｐB R3２2）由于不能如此自由地复制,所以需要在得到部分生长得细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主得蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体得复制，然而,松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样,像pBR３２２－类得质粒，从经氯霉素处理与未经处理得培养物中提取质粒得产量迥然不同,前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成得氯霉素μｇ/ml)已成为标准得操作、用该方法提取得质粒DNＡ量,对于分子克隆中几乎所有想象到得工作任务。
（二）细菌得收获与裂解细菌得收获可通过离心来进行,而细菌得裂解则可以采用多种方法中得任意一种,这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于3个因素：质粒得大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DＮＡ得技术。
尽管针对质粒与宿主得每一种组合分别提出精确得裂解条件不切实际,但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意得结果.ﻭ1)大质粒(大于15kb）容易受损,故应采用漫与裂解法从细胞中释放出来.将细菌悬于蔗糖等渗溶液中,然后用溶菌酶与ＥDTA进生处理，破坏细胞壁与细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
实验一 质粒DNA的小量制备
实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）实验步骤：1.取1.5ml培养物于EP管中，13000 rpm离心1min集菌，去上清；2.加入100μL预冷的溶液Ⅰ，振荡器剧烈振荡，使菌体悬浮；3.加入200uL现配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min（整个过程不能超过5min）盖管口，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min（不能超过5min）；4.加入150uL的溶液Ⅲ，温和颠倒数次以混合均匀，冰浴 10min；5.13000rpm离心10min，取上清于另一离心管。
6.加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），温和振荡；7.13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管内；8.加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），温和振荡；9.13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管内；10.加入两倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），混合均匀后置于-20℃15-30min， 13000rpm离心15min去上清；11.用70%乙醇洗一次，13000rpm离心5min，弃上清，将离心管倒置，室温干燥5-10min。
12.用20－30uL TE缓冲液（含RNA酶20ug/ml）溶解。
-20℃保存.13.取少量溶液稀释后分别在紫外分光光计上测OD260及OD280吸光值，计算DNA浓度，并做琼脂糖凝胶电泳分析。
分装后-20℃保存备用。
主要试剂：溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris-HCL(pH8.0)10 mmol/L EDTA((pH8.0)溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH1% SDS溶液Ⅲ： 3 mol/L 乙酸钾2 mol/L醋酸TE 缓冲液：10mmol/L Tris pH 8.01 mmol/L EDTA pH 8.0 高压灭菌结果1.图示质粒DNA电泳结果，并分析之。
2.计算制备的质粒DNA的含量。
质粒提取
质粒DNA小量制备1、实验准备：1）、仪器：台式微量高速离心机、水浴锅2）、试剂：天根离心柱型质粒小提试剂盒、菌液（过夜）3）、器材：1000ul、200ul移液枪及枪头（枪头高压处理）、1.5mlEP 管、双面板、计时器、记号笔2、试验流程1）、含质粒菌液制备第一天菌种复苏A、准备：甘油菌、LB（kana+）平板、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：取-800C 保存的甘油菌种，用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将粘附在接种环上的细菌划在LB 平板平面，将冻结的培养物放回-800C 保存，平板于370C 培养过夜（12~16h）第二天增菌A、准备：含有单克隆菌落的LB 平板、5ml LB 菌液、酒精灯、打火机、接种环、标记笔B、操作：a）、5ml LB 菌液+ 5ul kana(50mg/ml)；b）、挑取单克隆接种于LB 液中；c）、180rpm, 370C, 12~16h 振荡培养注意：细菌复苏非常重要，如果细菌生长不好，可再次将5ul 菌液接种于3-5ml 培养基中，震荡培养过夜。
第三天质粒提取（参考试剂盒说明书）1、柱平衡操作：向吸附柱CP3中（吸附柱置于收集管中），加入500ul 平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
2、取1~5ml过夜菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，到掉上清液。
（菌液较多时，可通过多次离心将菌体沉淀全部收集到一个离心管中）3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul的溶液P1，（请检查是否已加入RNaseA），使用漩涡振荡器或移液枪彻底混匀细菌沉淀。
4、向离心管中加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转6~8次，使菌体裂解。
5、向离心管中加入350ul的溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
6、将上一步收集的上清液用移液枪转移至吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意不要吸出沉淀，12000rpm离心30~60S（一般取45S），倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放入收集管中。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备[摘要] 从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，因而被各实验室广泛采用。
[关键词] 质粒dna 碱裂解法快速提取（一）实验目的及原理从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的dna可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
（二）试剂与器材1.器材：微量移液器、1.5ml离心管、各种移液器头、台式高速离心机、高压灭菌锅、冰块2.试剂：（1）溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta，20mmol/l 25mmtris-hcl ph8.0。
（2）溶液ⅱ：0.4mol/l naoh（临用前用10mol/l naoh贮存液现用现稀解），2%sds sds（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制。
（3）溶液ⅲ：60ml 5mol/l 醋酸钾，5ml冰醋酸，28.5ml h2o。
（4）te缓冲液：10mmol/l tris-hcl, 1mmol/l edta（ph8.0）。
（5）100%乙醇，70％乙醇。
（6）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液或30％的甘油。
（7）5×tris-硼酸（tbe）缓冲液。
（8）5×tris-乙酸（tae）缓冲液。
3.材料：（1）含puc系列质粒的大肠杆菌；（2）琼脂糖。
（三）实验步骤1.质粒dna的小量提取。
(1)取四支1.5ml离心管，编号为1、2、3、4。
用加样枪加各个溶液。
(2)分别吸取200μl培养液加入这四个离心管中，在离心机（12 000r/min）离心10min，弃上清液，收集菌体。
(3)在1、2、3号分别加入200μl溶液ⅰ，4号加入用等量蒸馏水代替，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮。
(4)在1、2、4号加入200μl溶液ii，在3号加入（未加naoh，只加了sds）的溶液ii轻柔颠倒混匀。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB（10ml5xLB+40mlH2O+50ul氨苄）加入到标记好的15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37度恒温箱振荡培养过夜。
2）将培养好色泽浑浊的培养物倒入标记好的微量离心管中，用离心机在室温以13000g离心1min。
3）吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（除去上清的最简便方法是用一次性的吸头接触液面轻缓吸取。
尽可能使吸头远离细菌沉淀）2.裂解1）在细菌沉淀上先加入250ul 冰箱保存的solution1，剧烈振荡（在微量离心管里加一根牙签，再在震荡机上使细菌沉淀迅速分散）（50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris.Cl,10mmol/L EDTA）2）然后加入250ul新配制solution2 盖紧管口，温和颠倒离心管5次，以混合内容物。
（应确保离心管整个内表面均与溶液接触）（0.2mol/L NaOH,1%SDS）3）加入350ul solution3盖紧管口，温和倒置振荡10秒钟，使粘稠的细菌裂解物分散均匀（5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml）4）再用离心机20000g离心10min，将上清液转移到标记好的2ml收集管中。
5）把收集管离心过柱1min后，倒掉滤液，再加500ul HBC Buffer清洗，离心1min倒掉滤液6）再用700ul DNA Wash Buffer清洗过柱离心1min倒掉滤液，重复2次。
7）再空离心2min后，将收集管过到新标记好的微量离心管·中，打开挥干2min8）最后再加入30-50ul 预热好的Elution Buffer溶解1min后，再离心机13000g离心1min 后，去掉收集柱，保留溶解液。
细菌质粒提取原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
分子生物学基础实验
分⼦⽣物学基础实验分⼦⽣物学基础实验实验⼀质粒DNA的⼩量制备⼀、实验原理载体:要把⼀个有⽤的外源基因通过基因⼯程⼿段，送进细胞中去进⾏繁殖和表达，需要运载⼯具，携带外源基因进⼊受体细胞的这种⼯具就叫载体是⼀个复制⼦，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；<2）载体在受体细胞中能⼤量增殖，只有⾼复制率才能使外源基因在受体细胞中⼤量扩增；<3）载体DNA链上有1到⼏个限制性内切酶的单⼀识别与切割位点，便于外源基因的插⼊；<4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因质粒质粒在细胞内的复制，⼀般分为两种类型：严密控制型40％－50％.质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍⽣的质粒.所有分离质粒DNA的⽅法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA.采⽤溶菌酶可破坏菌体细胞壁，⼗⼆烷基硫酸钠质粒DNA的相对分⼦量⼀般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分⼦质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分⼦质量为1.7×106.在细胞内，共价闭环DNA⼆、实验⽬的1．掌握最常⽤的提取质粒DNA的⽅法和检测⽅法.2．了解制备原理及各种试剂的作⽤.三、实验材料和试剂材料：⼤肠杆菌E.coli，质粒pegf.试剂：LB培养基：10g/L胰蛋⽩胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，⽤NaOH调pH⾄7.3左右.如固体培养基则添加15g/L琼脂.溶液Ⅰ溶液Ⅱ<0.2mol/LNaOH(内含1％SDS>）：预先配制1％SDS母液，临⽤前⼀天晚上加⼊0.2mol/LNaOH，4℃保存.溶液Ⅲ酚/氯仿液(V/V＝1/1>：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加⼊异戊醇，使其体积⽐为24:1，然后等量的加⼊重蒸酚，混匀，并⽤0.1mol/LTris-HCl (pH7.6>抽提⼏次以平衡这⼀混合物，于棕⾊瓶中存放，并在上⾯覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6>，4℃保存.6.⽆⽔⼄醇7.70％⼄醇pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20µg/mL.仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净⼯作台、⾼压蒸汽灭菌锅、台式⾼速离⼼机、台式⼩型振荡器、EP管(1.5mL微量离⼼管>、加样器(20uL～lmL>、吸头.四、操作步骤<⼀）培养细菌将带有质粒pegf的⼤肠杆菌接种在含50µg/mL卡那霉素(Ka+>的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜.注意：添加Ka+时，须待LB 培养基冷却到50℃左右⽅可加⼊.<⼆）从菌落中快速提取制备质粒DNA1．取1.5mL(750uL取两次>菌液置于1.5mL Ep管中，10000rpm 离⼼3min.2．弃上清，重复步骤1，弃上清，加⼊150µL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀.3．加⼊300µL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS>，加盖，颠倒<不要振荡）3次，使之混匀.4．加⼊225µL冰冷的⼄酸钾溶液.加盖后，颠倒<不要振荡）3次使之混匀.5．10000rpm离⼼5min，上清液吸⾄另⼀⼲净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离⼼⼀次.6．于上清液中加等体积氯仿，振荡混匀，10000rpm离⼼5min，⼩⼼吸取上清液，转移⾄另⼀⽀1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的⽩⾊蛋⽩薄层吸出.7．向上清液加⼊2倍体积⽆⽔⼄醇，混匀，⽤离⼼机于10000rpm 离⼼5min.⼩⼼吸去上清液.8．⽤0.5mL 70％⼄醇洗涤沉淀⼀次，10000rpm离⼼5min，除尽⼄醇，室温⾃然⼲燥(将离⼼管倒置于⼀张纸⼱上>，备⽤. 9．⽤20uL TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供电泳使⽤.贮存于-20℃备⽤，可长期保存.实验⼆ DNA的含量、纯度与分⼦量的电泳法测定⼀、实验原理测定核酸通常采⽤两种⽅法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法.1．紫外分光光度法DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数.根据计算在260nm波长下，每1ug/mL DNA钠盐的A值为0.20，即在A260=1时，双链DNA含量为50ug/mL，单链DNA与RNA含量为40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为33 ug/mL.双链DNA含量＝A260×50×稀释倍数RNA含量＝A260×40×稀释倍数单链DNA含量＝A260×33×稀释倍数此外还可以根据260nm和280nm的读数间的⽐值2．琼脂糖凝胶电泳法根据DNA分⼦量不同，采⽤外加电场使其分开，⽤EB嵌⼊DNA 分⼦后在紫外下显荧光.⽽荧光强度正⽐于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度.电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照⽚上⽐较鉴别.由于电泳时所⽤的样品量⾮常少，只要将浓度控制在⼏⼗纳克即可，所以在基因⼯程中经常被⽤做检测DNA样品.表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA⽚断⼆、实验⽬的1．从以上实验中提取到的质粒DNA，为了能作下⼀步的酶切，连接及转化实验，必须测定DNA的纯度、含量以及分⼦量⼤⼩.2．本实验旨在学习⽔平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相对分⼦质量⼤⼩.三、实验材料和试剂材料：⾃制的质粒DNA、λDNA/ Hind Ⅲ、.试剂：1．标准DNAmarker(λDNA/ Hind Ⅲ>2．限制性内切酶HindⅢ和10X缓冲液3．酶反应中⽌液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖>，已配好.4．溴化⼄锭染液5．0.5×TBE缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g ⽤蒸馏⽔定容⾄400mL.可配成5×TBE母液，使⽤时稀释10倍即可.6．0.7％琼脂糖仪器：37℃⽔浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式⼩型振荡器、Ep管(1.5mL>、加样器(20uL～lmL>、吸头.四、实验操作<⼀）质粒DNA的酶解1．新提的质粒，在10uL的体系中⽤单⼀酶<如E co RⅠ）进⾏处理，即：质粒DNA 2µL10×缓冲液1µLE co RⅠ0.5µLddH2O 6.5µL2．37℃，保温30min.3．加⼊1/10体积的酶反应终⽌液，混匀以停⽌酶解反应.各酶解样品于冰箱中贮存备⽤.<⼆）琼脂糖凝胶板的制备1．琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加⼊100mL TBE缓冲液，瓶⼝倒扣⼀⼩烧杯，于电炉上加热，注意：防⽌溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果⽔分损失较⼤，则补充⼀定量的蒸馏⽔，使其终浓度为1％.2．胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾⼲.取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成⼀个边脚模⼦.注意：将橡⽪膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙.将有机玻璃内槽置于⽔平位置，放好样品槽模板(⼀般称之为梳⼦>，将冷却⾄65℃左右的琼脂糖凝胶，⼩⼼地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层.室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽.将有机玻璃内槽放⼊电泳槽中，加⼊0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜.胶板内的样品⼩槽3．加样⽤微量加样器将上述样品分别加⼊胶板的样品⼩槽内，每次加完⼀个样品为了避免交叉污染，各样品⽤不同的吸头，以免造成限制酶被污染.加样时，吸头不要插⼊胶板内，防⽌碰坏样品槽周围的凝胶⾯，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右.4．电泳加完样品后应⽴即通电，进⾏恒压电泳.在低压条件下，线形DNA ⽚段的迁移速度与电压成⽐例关系，为了获得电泳分离DNA ⽚段的最⼤分辨率，电场强度不应⾼于5V/cm.当溴酚蓝染料<蓝⾊）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停⽌电泳.5．染⾊将电泳后的凝胶浸⼊EB染液中，进⾏染⾊以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带.染⾊15min后，⽤⼤量⽔冲洗.6．观察在波长为254nm的紫外灯下，观察染⾊后的电泳凝胶.DNA存在处显⽰出红⾊荧光条带.⽤凝胶⾃动成像仪处理代替.实验三感受态细胞的制备及转化⼀、实验原理感受态就是细菌吸收转化因⼦的⽣理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分⼦.转化是将外源DNA分⼦引⼊受体细胞，使之获得新的遗传性状的⼀种⼿段.转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表⾯，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化⼦.⼆、实验⽬的1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备⽅法. 2．掌握质粒的转化⽅法.把体外DNA引⼊受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化⼦.三、实验材料和⽤具材料：⾃制的质粒DNA、⼤肠杆菌(E.coli>菌种(DH5α菌株>.试剂：LB琼脂平板 (⽆抗⽣素>、LB琼脂平板 (含50µg/L卡那霉素>、LB液体培养基5mL(⽆抗⽣素>、LB液体培养基100mL(⽆抗⽣素>、LB液体培养基5mL(含50µg/L卡那霉素>、0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备⽤>.仪器：恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离⼼机、离⼼管、超净⼯作台、⾼压蒸汽灭菌锅.四、操作步骤(⼀>⼤肠杆菌感受态细胞的制备1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取⼀单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直⾄对数⽣长期.将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h.2．取5mL培养液放⼊离⼼管中， 5000rpm离⼼10min.3．可⽤加样器将残余液体尽量去净，⽤1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min.4． 5000rpm离⼼10min.5．弃上清，加⼊200µL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，⼩⼼悬浮细胞，冰上放置⽚刻，即制成了感受态细胞悬液.6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接⽤于转化实验，也可加⼊占总体积95％左右⾼压灭菌过的⽢油，混匀后分装于Ep管中，-70℃条件下可保存半年⾄⼀年.(⼆>细胞转化将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min 后，于42℃⽔浴中保温90s ，然后迅速在冰上冷却3～5min.上述各管中分别加⼊400µL LB 液体培养基，使总体积为500µL ，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养45~60min ，使受体细胞恢复正常⽣长状态，并使转化体产⽣抗药性.(三>平板培养取各样品培养液100µL 分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB 平板培养基上(分别记为Ka ＋和Ka —>，涂匀.37℃培养24h ，待菌落⽣长良好且未相互重叠时停⽌培养.(四>检出转化体五、注意事项1．这⼀个实验中的所有操作均要为⽆菌操作，在超净⼯作台内进⾏.2．细胞转化中，42℃⽔浴90s 要准确操作.3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的⼀定不要在室温中放置.六、思考题1．质粒的基本性质有哪些？答：质粒主要在基因⼯程中⽤于重组质粒的构建.所以它有以下性质:(1>质粒能在寄主细胞中“友好”地“借居”，能够⾃我复制，或整合到染⾊体上，随染⾊体进⾏复制.<2）有多个限制酶切点(便于进⾏切割><3）有标记基因,以便于进⾏检验是否成功导⼊受体细胞.(2>为什么质粒DNA 不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这⼀⽬的，需要注意些什么？答：将质粒DNA 反复在4摄⽒度，-20摄⽒度放置，室温中放置会导致环状的DNA 的断裂成线性的分⼦，不能得到环状的DNA 分⼦.所基含抗⽣素培养基结果分析受体菌对照组有⼤量菌落长出⽆菌落长出本实验未产⽣抗药性菌株质粒对照组⽆菌落长出⽆菌落长出质粒DNA 不含杂菌转化实验组有⼤量菌落长出有菌落长出质粒进⼊受体菌中产⽣抗药性以为了避免这⼀问题对于提取的DNA,因根据使⽤其的时间不同⽽作区别的处理：对于近段时间就要⽤的质粒DNA因根据使⽤⽽对于长时间不⽤的质粒DNA，则应保存在-20摄⽒度的冰箱中，因为在相对低的温度下质粒可以保存较长的时间.申明：所有资料为本⼈收集整理，仅限个⼈学习使⽤，勿做商业⽤途。
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二 实验试剂
• pGEX-6p质粒载体菌, • LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素）
， • 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I）， • NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）
(溶液 III)， • RNase A， • 95%乙醇，70%乙醇， • TE buffer（pH8.0）。
，补dd water至100ml），
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三 实验准备
• 4 70%乙醇（-20C保存）， • 5 TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0
，1mmol/L EDTA pH8.0）； • 6 摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离
心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相 应的吸头盒，一起高压灭菌（121C 30min）。
• 5加入200l 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次 ，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与 溶液Ⅱ接触。不要振荡，插入冰中，放置5min。
• 6 加入用冰预冷的150l 溶液III，盖上盖后上下颠倒 几次混匀，插入冰中，放置5min。
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四 操作步骤
• 7 12000 rpm离心5min，小心吸取400l 上清液于另 一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带 入！），加入800l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡 旋混合器上混匀，室温下静置5min。
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四 操作步骤
• 1 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入 灭菌的摇菌管中。
• 2 取出保存pGEX-6p载体的菌种, 在超净工作 台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于 5ml无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素 ）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。
• • 3取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，12000
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三 实验准备
• 1 氨苄青霉素储存液（无菌水配制 5mg/ml，分装后-20C保存），
• 2 配制LB培养基 （胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl
10g加200mL dd water 搅拌完全溶解， 用约200L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌）；
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一 实验原理
• 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑 学上的差异来分离。
• 在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性。
• 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中 性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性 的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和 大分子RNA一起沉淀下去。
• 12 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶 液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下 水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告
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五 思考题
• 影响本实验结果的因素有哪些？
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ห้องสมุดไป่ตู้
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三 实验准备
3溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；
• 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在 10lbf/in2(6.895¡104Pa) 高压下蒸气灭菌15分 钟，贮存于4℃。
• 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）； • 溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8
实验一 质粒DNA的小量制备
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一 实验原理
• 什么是质粒？
• 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进 行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复 制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外 ，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基 因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可 通过连接外源基因构成重组体。
rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净）， 留沉淀备用。
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四 操作步骤
• 4在沉淀中加入用冰预冷的100l 溶液I，盖上盖后立 即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待 的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。） 须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量 离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散 。
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四 操作步骤
• 10 离心管倒置于37C培养箱中（或室温） 空气干燥10分钟。。（管底的沉淀质粒DNA 用肉眼几乎看不见！）。
• 11 每管加入10LTE缓冲液混匀后收集到一 个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬 时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认 ，用记号笔标记后放入冰箱中备用。
• 8 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入 500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混 匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量 倒置弃干净,
• 9 再加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合 器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液 ，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上 ，以使所有液体流出。