分子诊断与临床PPT课件
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定义
➢不同来源的、具有互补序列的两 条核酸单链
➢在一定条件下通过碱基配对原则 形成双链的过程
分子杂交技术的理论基础
DNA（RNA）的变性与复性
16
核酸分子杂交
基本类型
➢Southern杂交-----待测核酸是DNA片段 ➢Northern杂交-----待测核酸是RNA片段 ➢衍生类型：斑点杂交、原位杂交 等
➢ 靶序列的扩增 ➢ SNP特异位点的区分
方法：杂交、PCR、分子构象、酶法等
➢ 数据的检测分析
方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、 质谱分析 等
27
主要的SNP检测方法
凝胶电泳分析技术
SSCP、TTGE、TGGE、DGGE
分子杂交技术
ASO、DASH、PNA杂交、LNA 杂交
荧光共振能量转移
Taqman探针技术、分子信标技术、 蝎状探针技术、替代探针技术
1. 核酸扩增 2. 分子克隆 3. 核酸分子杂交 4. DNA测序 5. 单核苷酸多态性分析技术 6. 生物芯片技术 7. 蛋白质组学技术 8. 生物信息学
12
1、PCR
体外核酸扩增 生物技术领域最重要四项技术之一
➢细胞整合技术 ➢分子克隆技术 ➢蛋白工程技术
13
模板DNA 94℃变性 55℃退火
分子诊断与临床
1
主要内容
1. 概述 2. 分子诊断的常用技术 3. 分子诊断在临床的应用 4. 分子诊断在应用中的问题及对策 5. 分子诊断的发展方向
2
检验医学
➢临床基础检验学 ➢临床生化检验学 ➢临床免疫检验学 ➢临床微生物检验学 ➢临床血液检验学 ➢临床寄生虫学 ➢临床分子诊断学(基因诊断=PCR?) ➢科研平台？
➢ MALDI-TOF MS ➢ 杂交测序法 ➢ 焦磷酸测序技术 ➢ 原子探针显微镜法 ➢ 单分子测序技术
自动化测序---常规应用
22
链末端终止法测序原理
化学降解法测序原理23
自动化测序
充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、
安全、精确、并行和高效等特点
目前，自动化测序已成为DNA序列分析的
32
7、蛋白质组学
蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基
因所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学：从整体的角度，分析细胞内动态变
化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了 解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功 能与细胞生命活动规律的相互关系。
➢研究对象的整体性 ➢研究目标的动态性 ➢体现生命的复杂性
28
PCR-SSCP
29
6、生物芯片技术
技术的核心：杂交技术
实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对）
步骤： 1. 已知物质点样（阵列） 2. 加标记的待测样品，杂交 3. 检测 4. 数据分析、处理
优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化
缺点：只能检测已知的大分子
不能发现未知的大分子
30
应用
核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基 因测序、基因图谱制作、多态性分析）、
药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定
主要类型
➢基因（DNA）芯片 ➢RNA芯片 ➢蛋白质芯片 ➢细胞芯片 ➢组织芯片 ➢芯片实验室 (Lab-on-a-chip )
31
6400点的基因芯片
（面积 12×14 mm)
17
Southern blot 操作 流程
18
19
斑点杂交示意图
20
4、DNA测序
已知序列的验证性测序策略 未知序列的从头测序策略
➢ 随机测序法 （鸟枪法、人工转座子法 ） ➢ 定向测序法 （引物测序法、互套缺失法 ） ➢ 全基因组测序策略
21
DNA测序常用技术
链末端终止法（ Sanger法） 化学降解法 测序新技术
33
蛋白质组学
研究范畴：
➢蛋白质与蛋白质间的相互作用 ➢蛋白质与核酸间相互作用 ➢蛋白质及其组成质点的分离、分析与鉴定 ➢蛋白质结构分析 ➢生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质表达
8
高通量技术
➢ 核酸测序技术—基因诊断的金标准 ➢ 生物芯片(基因芯片)技术 ➢ 蛋白质组学技术
✓ 2-DE ✓ 质谱技术：MALDI-TOF ✓ 组织芯片 ✓ 蛋白质组信息学
9
RLFP原理
10
FISH
[ NTERT-1与人着丝粒DNA片段杂交（绿），与人端粒DNA片段杂交（红）]
11
二、几种常用的分子诊断技术
72℃引物延伸 第二次循环
模板变性退火 延伸
经25-30次循环，目的DNA增加106-7
PCR原理示意图
14
2、分子克隆
（基因克隆，基因重组）
基本步骤 ➢分 ➢切 ➢接 ➢转 ➢筛
切
全基 分
载体
+
目因的基因
连
+
DNA重组体
受体细胞
转
转化、筛选和 鉴定阳性克隆
筛
含重组子的阳性克隆
15
3、核酸分子杂交
主流，几乎完全取代了手工测序
类型：
➢ 基于单一荧光染料标记的自动化测序系统 ➢ 基于多种荧光染料标记的自动化测序系统
24
单荧光
多荧光（四荧光）
25
377型DNA 全自动测序仪
26
5、单核苷酸多态性分析技术
SNP：第三代遗传标志，是决定人类疾病
易感性和药物反应差异性的主要因素
SNP检测技术基本步骤
大分子体系
➢基因 ➢细胞 ➢组织
5
细胞核 DNA
转录 细
胞
mRNA
膜 翻译
蛋白质
分子 诊 断 生化学诊断
临床表现
不同诊断方法的研究对象
血清学诊断 临床学诊断
6
分子诊断的策略
遵循实验诊断学的基本原则
不同疾病及病因采用不同方法 根据检测目的开展不同层次的检测 注重环境基因组学研究成果 发挥在耐药性方面的潜在作用 在疾病预测、健康检查、个体化治疗中的作用 关注分子诊断中的医学论理和生物安全问题 开发简便、快速、准确、特异、灵敏的方法
7
二、分子诊断的主要技术
低通量技术
➢ DNA分析：Southern blot、PCR、RFLP、 ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量 测定
➢ 染色体分析：FISH、CGH ➢ RNA分析：ISH、Northern blot、RT-PCR ➢ 蛋白质分析：IHC、Western blot
3Leabharlann Baidu
分子诊断学
以分子生物学理论为基础 利用分子生物学的技术和方法 研究人体内源性或外源性的生物大分子
（如DNA、RNA和蛋白）和大分子体系的 存在、结构或表达调控的变化
为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归
提供信息和决策依据
检验医学的分支学科之一
4
分子诊断学的研究对象
生物大分子
➢核酸：DNA、RNA ➢蛋白
➢不同来源的、具有互补序列的两 条核酸单链
➢在一定条件下通过碱基配对原则 形成双链的过程
分子杂交技术的理论基础
DNA（RNA）的变性与复性
16
核酸分子杂交
基本类型
➢Southern杂交-----待测核酸是DNA片段 ➢Northern杂交-----待测核酸是RNA片段 ➢衍生类型：斑点杂交、原位杂交 等
➢ 靶序列的扩增 ➢ SNP特异位点的区分
方法：杂交、PCR、分子构象、酶法等
➢ 数据的检测分析
方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、 质谱分析 等
27
主要的SNP检测方法
凝胶电泳分析技术
SSCP、TTGE、TGGE、DGGE
分子杂交技术
ASO、DASH、PNA杂交、LNA 杂交
荧光共振能量转移
Taqman探针技术、分子信标技术、 蝎状探针技术、替代探针技术
1. 核酸扩增 2. 分子克隆 3. 核酸分子杂交 4. DNA测序 5. 单核苷酸多态性分析技术 6. 生物芯片技术 7. 蛋白质组学技术 8. 生物信息学
12
1、PCR
体外核酸扩增 生物技术领域最重要四项技术之一
➢细胞整合技术 ➢分子克隆技术 ➢蛋白工程技术
13
模板DNA 94℃变性 55℃退火
分子诊断与临床
1
主要内容
1. 概述 2. 分子诊断的常用技术 3. 分子诊断在临床的应用 4. 分子诊断在应用中的问题及对策 5. 分子诊断的发展方向
2
检验医学
➢临床基础检验学 ➢临床生化检验学 ➢临床免疫检验学 ➢临床微生物检验学 ➢临床血液检验学 ➢临床寄生虫学 ➢临床分子诊断学(基因诊断=PCR?) ➢科研平台？
➢ MALDI-TOF MS ➢ 杂交测序法 ➢ 焦磷酸测序技术 ➢ 原子探针显微镜法 ➢ 单分子测序技术
自动化测序---常规应用
22
链末端终止法测序原理
化学降解法测序原理23
自动化测序
充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、
安全、精确、并行和高效等特点
目前，自动化测序已成为DNA序列分析的
32
7、蛋白质组学
蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基
因所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学：从整体的角度，分析细胞内动态变
化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了 解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功 能与细胞生命活动规律的相互关系。
➢研究对象的整体性 ➢研究目标的动态性 ➢体现生命的复杂性
28
PCR-SSCP
29
6、生物芯片技术
技术的核心：杂交技术
实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对）
步骤： 1. 已知物质点样（阵列） 2. 加标记的待测样品，杂交 3. 检测 4. 数据分析、处理
优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化
缺点：只能检测已知的大分子
不能发现未知的大分子
30
应用
核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基 因测序、基因图谱制作、多态性分析）、
药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定
主要类型
➢基因（DNA）芯片 ➢RNA芯片 ➢蛋白质芯片 ➢细胞芯片 ➢组织芯片 ➢芯片实验室 (Lab-on-a-chip )
31
6400点的基因芯片
（面积 12×14 mm)
17
Southern blot 操作 流程
18
19
斑点杂交示意图
20
4、DNA测序
已知序列的验证性测序策略 未知序列的从头测序策略
➢ 随机测序法 （鸟枪法、人工转座子法 ） ➢ 定向测序法 （引物测序法、互套缺失法 ） ➢ 全基因组测序策略
21
DNA测序常用技术
链末端终止法（ Sanger法） 化学降解法 测序新技术
33
蛋白质组学
研究范畴：
➢蛋白质与蛋白质间的相互作用 ➢蛋白质与核酸间相互作用 ➢蛋白质及其组成质点的分离、分析与鉴定 ➢蛋白质结构分析 ➢生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质表达
8
高通量技术
➢ 核酸测序技术—基因诊断的金标准 ➢ 生物芯片(基因芯片)技术 ➢ 蛋白质组学技术
✓ 2-DE ✓ 质谱技术：MALDI-TOF ✓ 组织芯片 ✓ 蛋白质组信息学
9
RLFP原理
10
FISH
[ NTERT-1与人着丝粒DNA片段杂交（绿），与人端粒DNA片段杂交（红）]
11
二、几种常用的分子诊断技术
72℃引物延伸 第二次循环
模板变性退火 延伸
经25-30次循环，目的DNA增加106-7
PCR原理示意图
14
2、分子克隆
（基因克隆，基因重组）
基本步骤 ➢分 ➢切 ➢接 ➢转 ➢筛
切
全基 分
载体
+
目因的基因
连
+
DNA重组体
受体细胞
转
转化、筛选和 鉴定阳性克隆
筛
含重组子的阳性克隆
15
3、核酸分子杂交
主流，几乎完全取代了手工测序
类型：
➢ 基于单一荧光染料标记的自动化测序系统 ➢ 基于多种荧光染料标记的自动化测序系统
24
单荧光
多荧光（四荧光）
25
377型DNA 全自动测序仪
26
5、单核苷酸多态性分析技术
SNP：第三代遗传标志，是决定人类疾病
易感性和药物反应差异性的主要因素
SNP检测技术基本步骤
大分子体系
➢基因 ➢细胞 ➢组织
5
细胞核 DNA
转录 细
胞
mRNA
膜 翻译
蛋白质
分子 诊 断 生化学诊断
临床表现
不同诊断方法的研究对象
血清学诊断 临床学诊断
6
分子诊断的策略
遵循实验诊断学的基本原则
不同疾病及病因采用不同方法 根据检测目的开展不同层次的检测 注重环境基因组学研究成果 发挥在耐药性方面的潜在作用 在疾病预测、健康检查、个体化治疗中的作用 关注分子诊断中的医学论理和生物安全问题 开发简便、快速、准确、特异、灵敏的方法
7
二、分子诊断的主要技术
低通量技术
➢ DNA分析：Southern blot、PCR、RFLP、 ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量 测定
➢ 染色体分析：FISH、CGH ➢ RNA分析：ISH、Northern blot、RT-PCR ➢ 蛋白质分析：IHC、Western blot
3Leabharlann Baidu
分子诊断学
以分子生物学理论为基础 利用分子生物学的技术和方法 研究人体内源性或外源性的生物大分子
（如DNA、RNA和蛋白）和大分子体系的 存在、结构或表达调控的变化
为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归
提供信息和决策依据
检验医学的分支学科之一
4
分子诊断学的研究对象
生物大分子
➢核酸：DNA、RNA ➢蛋白