PCR的退火温度选择

熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。

有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。

有的是根据GC含量估算Tm。

确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。

这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。

大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。

因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。

可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。

开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。

退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是
引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜
个引物退火温度计算器输入序列就可以了。

退火时间一般都是30秒。

试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点
是没有什么问题的
bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大
我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）
+2（A+T）
增加PCR的特异性：
1. primers design
这是最重要的一步。

理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量
b. GC% 40%~~~~60%
c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC
e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
f. 避免3'端的错配
g. 避免部形成二级结构
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们
i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)
j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。

有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。

有的是根据GC含量估算Tm。

确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。

这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。

大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。

因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。

可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。

开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2. stability of primers
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。

引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。

定制引物以干粉形式运输。

最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。

TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。

引物的稳定性依赖于储存条件。

应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。

以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。

干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg离子的作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg 离子的浓度，对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液
b. 其他的离子
NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的情况下, 变性的
温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性
d. template
50ul PCR SYSTEM
================================
human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
LamadaDNA 0.5ng-5ng
Plasmid DNA 0.1ng-10ng
================================
4. termperature
a. denaturation
常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟
除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation
b. annealing
重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因
为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很简单,但的确是一个很有用的方法。

举个例子，ANNEALING TEMP. 55度
94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s
72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s
51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s
72 1min 20cycles 72 5min
6. hot start PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

尽管Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。

因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。

这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。

在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed 突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。

限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。

这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。

包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。

其他的热启动
方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。

在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。

有很多公司提供这样的酶。

=======================
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
=========================
象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。

还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。

7. Booster PCR
我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.
具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平
8. 循环数和长度
确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造成ERRORS和非特异性产物的积累产物的量不够, 优化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循环数
如何确定循环数,有一个方法.
做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数
另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地
9. thermal cycler
PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错
配, 增加产物的长度和产量.
在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合
gradient pcr选择最优条件.
====================================================
dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extender (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度
11. Template DNA preparation
提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如
Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.
12. Nested PCR
简单点说设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.
增加PCR的保真性
高保真酶
高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型
a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的
合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变
b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如
Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如
pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。

但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。

酶的混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。

其他因素
除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。

将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM 可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。

进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。

1．简介
寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。

所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。

好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。

引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。

当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。

计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。

一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。

计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。

通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。

因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。

需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5’端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。

2．基本PCR引物设计参数
引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

特异性是指发生错误引发的频率。

特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。

①引物长度；
特异性一般通过引物长度和退火温度控制。

如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的围，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。

引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。

为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。

总的来说，最好在特异性允许的围寻求安全性。

每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。

引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。

②引物的二级结构
包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。

这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。

对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。

引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。

应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。

③引物GC含量和Tm值
PCR引物应该保持合理的GC含量。

含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃围，这可为有效退火提供足够热度。

一对引物的GC含量和Tm值应该协调。

协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。

这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。

若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。

在从一批在特定序列围已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。

一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度围较好。

④引物的额外序列与退火温度
若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。

一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。

有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。

在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。

长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。

对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。

而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。

⑤引物的3’末端核苷酸组成
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。

如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。

引物3’末端的另一个问题是防止一对引物的同源性。

应特别注意引物不能互补，尤其是
在3’末端。

引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。

这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。

引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。

此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。

需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。

实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或C 错配仍可有效延伸。

⑥PCR产物的长度及在耙序列的位置
所有的计算机程序都提供对PCR产物长度围的选择。

一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。

特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。

预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。

若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120～300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。

产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。

这一长度围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。

其他PCR方法有不同的最佳产物长度。

例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。

这些产物一般在250～750bp围。

⑦补充说明
若在cDNA序列找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA 的编码区域，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。

若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。

在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。

在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。

3．简并引物设计
①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。

很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。

②充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

③应努力避免3’末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。

④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

4．测序引物设计
当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：
①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。

因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。

②测序引物的Tm值适当高一些。

现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。

选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

5．探针的设计
探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论：
①探针的长短一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。

太短则特异性下降。

②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。

③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。

④如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在70%以下。

PCR中常见问题分析与对策．
PCR产物的电泳检测时间
一般认为PCR产物应在48h以完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型就会出现不规则，甚至消失。