PCR的变性温度和时间设置

模板变性温度与变性时间

①变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA 模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要;反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq dna聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

②变性：第一步变性（预变性）在94℃下进行5 or 10分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA 脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。