第三章高效液相色谱法A
第三章 液相色谱法
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
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四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
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第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
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液相色谱仪（1）
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液相色谱仪（2）
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液相色谱仪（3）
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液相色谱仪（4）
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一、高效液相色谱法的特点
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流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
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色谱方法选择
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Polarity (极性）
Non-polar
高效液相色谱分析HPLC31高效液相色谱的特点
4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g
荧光检测器10-11g
第7讲
高效液相色谱
第2页
5．高度自动化计算机的应用:使 HPLC 不仅能自动 处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自 动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳 状态下工作，成为全自动化的仪器。
6．应用范围广（与气相色谱法相比）: HPLC 可用 于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机 化合物及各种离子的分离分析。如氨基酸、蛋白 质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。 大约占有机物的70-80%。
1）输出有脉冲波动，会干扰检测器正常工作；2） 由于产生基线噪声而影响检测的灵敏度。
第7讲
高效液相色谱
第24页
b.气动放大泵—恒压泵 原理： p1SA = p2SB 特点82/-6:能供给无脉冲的稳定流量的输
出。 不足82/-8： 1）液缸体积大，更换流动相不方便； 2）不便于梯度洗提。
第7讲
2、洗脱方式
a.键合薄壳型：担体，薄壳玻珠； b.键合微粒担体型：担体，微粒硅胶. 四、排阻色谱法固定相 a.软质凝胶：葡萄糖凝胶；琼脂糖凝胶； b.半硬质凝胶：交联聚苯乙烯凝胶； c.硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；
第7讲
高效液相色谱
第21页
§3-5 液相色谱法流动相
1.重要性：GC载气仅三四种，要提高柱效选择性， 主要是改变固定相的性质；
LC则不同，当固定相选定时，流动相的种类，配 比能显著地影响分离效果，因此流动相的选择很重 要。
2.选择流动相应注意的因素79/2：5点，
3.溶剂的选择79/-3：
a. 依据：溶剂的极性是重要依据。
b.溶剂极性顺序，水最大，煤油最小。
c.采用多元组合溶剂系统作为流动相（底液和洗 脱 液）
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
第三章药物的杂志检查
第三章药物的杂志检查（一）最佳选择题1．下列属于信号杂质的是A．砷盐B．硫酸盐C．铅D．氰化物E．汞2．酶类药物中酶类杂质的检查可采用的方法是A．HPLC法B．TLC法C．UV法D．CE法E．GC法3．药物中无效或低效晶型的检查可以采用的方法是A．高效液相色谱法B．红外分光光度法C．可见一紫外分光光度法D．原子吸收分光光度法E．气相色谱法。
4．原子吸收分光光度法检查药物中金属杂质时，通常采用的方法是A．内标法B．外标法C．加校正因子的主成分自身对照法D．标准加入法E．不加校正因子的主成分自身对照法5．氯化物检查法中，适宜的酸度是A．50ml中加2ml稀硝酸B．50ml中加5ml稀硝酸C．50ml中加l0ml稀硝酸D．50ml中加5ml硝酸E．50ml中加l0ml硝酸6．氯化物检查法中，用以解决供试品溶液带颜色对测定干扰的方法是A．活性炭脱色法B．有机溶剂提取后检查法C．内消色法D．标准液比色法E．改用他法7．BP采用进行铁盐检查的方法是A．古蔡氏法B．硫氰酸盐法C。
巯基醋酸法D．硫代乙酰胺法E．硫化钠法8．采用硫氰酸盐法检查铁盐时，若供试液管与对照液管所呈硫氰酸铁的颜色较浅不便比较时，可采取的措施是A．内消色法B．外消色法C．标准液比色法D．正丁醇提取后比色法E．改用他法9．下列试液中，用作ChP重金属检查法中的显色剂的是A．硫酸铁铵试液B．硫化钠试液C．氰化钾试液D．重铬酸钾试液E．硫酸铜试液10.硫代乙酰胺法检查重金属时，受溶液pH影响较大，适合的pH是A. 11.5B.9.5C.7.5D.3.5E.1.51 1．采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有色需在加硫代乙酰胺前在对照溶液管中加入的是A．过氧化氢溶液B．稀焦糖溶液C．盐酸羟胺溶液D．抗坏血酸E．过硫酸铵12.采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有微量高铁盐存在，需加入的是A．碘试液B．重铬酸钾溶液C．高锰酸钾溶液D．抗坏血酸E．过硫酸铵13.采用炽灼后硫代乙酰胺法检查重金属时，应控制的炽灼温度范围是A. 500 – 600℃B.600 -700℃C.700 - 800℃D. 800一900℃E.900 – l000℃14.乳酸钠溶液中重金属的检查应采用的方法是A．硫代乙酰胺法B．炽灼后硫代乙酰胺法C．古蔡氏法D．硫化钠法E．硫氰酸盐法15. USP收载的砷盐检查法是A．古蔡氏法B．Ag(DDC)法C．次磷酸法E．亚硫酸法D．白田道夫法16. ChP古蔡氏法检查砷盐，加入碘化钾的主要作用是A．将五价的砷还原为砷化氢B．将三价的砷还原为砷化氢C．将五价的砷还原为三价的砷D．将氯化锡还原为氯化亚锡E．将硫还原为硫化氢17.在古蔡氏检砷法中，加入醋酸铅棉花的目的是A．除去硫化氢的影响B．防止瓶内飞沫溅出C．使砷化氢气体上升速度稳定D．使溴化汞试纸呈色均匀E．将五价砷还原为砷化氢18. ChP采用Ag( DDC)法检查砷盐时，为吸收反应中产生的二乙基二硫代氨基甲酸，加入的试剂是A．吡啶B．三乙胺一三氯甲烷C．二氯甲烷D．氢氧他钠E．正丁醇19．ChP检查葡萄糖酸锑钠中的砷盐时，采用的方法是A．古蔡氏法B．Ag(DDC)法C．白田道夫法D．次磷酸法E．亚硫酸法。
高效液相色谱法教程
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
全多孔型固定相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
第二节 高效液相色谱仪
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量
论文标题高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量班级药学30801专业名称药学系部名称制药工程系河北化工医药职业技术学院毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。
尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。
对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
作者签名：日期：指导教师签名：日期：使用授权说明本人完全了解大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。
作者签名：日期：学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
涉密论文按学校规定处理。
作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日目录摘要 (3)第一章：大黄的概述 (3)§1-1基本信息 (3)§1-2化学成分 (4)§1-3药效作用 (4)1-3-1消化系统的影响 (4)1-3-2对血液系统的影响 (4)1-3-3抗感染作用 (5)§1-4不良反应 (5)§1-5现代研究 (5)第二章：高效液相色谱法测大黄中大黄素和大黄酚的含量 (6)§1-1仪器与试剂 (6)1-1-1仪器 (6)1-1-1试剂 (6)§2-2方法与结果............................................................. (7)2-2-1色谱条件 (7)2-2-2对照品的制备 (7)2-2-3供试品的制备 (7)2-2-4阴性对照溶液的制备 (7)2-2-5干扰试验 (7)2-2-6标准曲线的绘制 (7)2-2-7精密度试验 (7)2-2-8重复性试验 (7)2-2-9稳定性试验 (7)2-2-10加样回收率试验 (8)2-2-11样品的测定 (8)第三章：讨论 (8)§3-1药材含量测定中提取剂的确定 (8)§3-2HPLC法中检测波长的确定 (8)§3-3HPLC法中线形范围的确定 (9)参考文献 (9)第一章：摘要论文题目：高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量摘要摘要内容：大黄是我国临床常用的中药之一，有“泻热通畅、凉血解毒、逐瘀通经、攻积导滞、利胆退黄”之功效，大黄中的有效成分有蒽醌类、芪类、苯丁酮类、鞣质类、色原酮类、萘类、有机酸、糖、蛋白质、甾醇等150多种成分。
1.液相色谱特点及主要类型、原理
二、 高效液相色谱方法的局限性
1．成本高，且易引起环境污染 2. 缺少通用型检测器 3. 不能替代毛细管气相色谱法分析组成复 杂的具有多种沸程的石油产品 4. 不能代替中、低压柱色谱法，分析受压 易分解、变性的具有生物活性的生化样 品。
三、 HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测 手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
(1).固定相传质阻力项
• 式中，df 为固定液涂层厚度；Ds 为组分 在固定液中的扩散系数；Cs为常数
(2) 流动相的传质阻力项：
• 式中，dp为填充物平均颗粒直径；Dm为 组分在流动相中的扩散系数；Cm为常数。
(3)滞留流动相的传质阻力项：
式中，Csm是与颗粒微孔和容量因子有关的 常数。
GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低 的样品，仅能分析有机物的20%.
• HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受 样品挥发性和热稳定性的限制。 • 分子量大、难气化、热稳定性差及高分 子和离子型样品均可检测，占有机物的 80%。
2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用
2、液-固吸附色谱
基本原理： 各组分在吸附剂上的吸附性 能的差别 固定相： 固体吸附剂 应用：对中等分子量的油溶性试样，对 具有官能团的化合物和异构体有较高选择 性；
3、离子交换色谱
基本原理：各离子组分在固定相上发生的反 复离子交换反应能力的差别； 固定相：阴（阳）离子交换剂 流动相：pH缓冲溶液（酸性、碱性） 应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核 酸、蛋白质等。
7、亲和色谱(AC) Affinity chromatograph
原理：利用生物大分子和固定相表
09第三章液相色谱
出峰顺序相反。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极 性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
非极性~中等极性组分（用于HPLC 80%）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
离子交换色谱 ion-exchange chromatography
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液 ；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组
4.7.2
离子色谱流程与装置类型
抑制型；非抑制型:
排阻色谱
size- exclusion chromatography
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可 对 相 对 分 子 质 量 在 100-105 范围内的化合物按质量分离
兼顾柱效和分析时间， 选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响因素
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
第三章
高效液相色谱
(High Performance Liquid Chromatography )(HPLC)
液相色谱仪
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量技术，可
以用于分离和测定复杂的混合物。
它基于物质在流动相（溶剂）和固定相（色谱柱上的填料）之间的相互作用的差异，利用流动相的流动将待测样品分离成不同的组分。
通过分析组分的保留时间和色谱峰的峰面积或峰高，可以定量不同组分的含量或浓度。
高效液相色谱测定法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，因此在许多分析领域得到广泛应用。
它可以应用于生物医药、环境监测、食品安全等多个领域，用于分析和监测有机化合物、无机化合物、药物、天然产物、食品成分等。
高效液相色谱测定法的基本步骤包括：样品预处理、制备流动相、样品进样、流动相流动、色谱柱分离、检测器检测、结果处理等。
根据样品的性质和分析要求，可以选择不同的检测器，如紫外检测器（UV）、荧光检测器、质谱检测器等。
需要注意的是，高效液相色谱测定法在操作过程中需要注意样品制备和仪器条件的优化，以提高分离效果和分析结果的准确性。
此外，也需要注意流动相成分的选择、色谱柱的使用寿命等因素对分离效果的影响。
高效液相色谱分析
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
五、 影响分离的因素 1. 影响分离的因素 （1） 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万 分之一，则速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可以忽 略不计，即： H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所 示。
5. 离子色谱 ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的 一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了 特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为 柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，
是测定混合阴离子的有效方法。
6. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键 合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C-18柱（反相柱）。
2. 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使
用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
高压 高速
3 . 流程及主要部件 （1） 流程
（2）主要部件
① 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10m），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
第三章药物的杂志检查【最新资料】
第三章药物的杂志检查（一）最佳选择题1．下列属于信号杂质的是A．砷盐B．硫酸盐C．铅D．氰化物E．汞2．酶类药物中酶类杂质的检查可采用的方法是A．HPLC法B．TLC法C．UV法D．CE法E．GC法3．药物中无效或低效晶型的检查可以采用的方法是A．高效液相色谱法B．红外分光光度法C．可见一紫外分光光度法D．原子吸收分光光度法E．气相色谱法。
4．原子吸收分光光度法检查药物中金属杂质时，通常采用的方法是A．内标法B．外标法C．加校正因子的主成分自身对照法D．标准加入法E．不加校正因子的主成分自身对照法5．氯化物检查法中，适宜的酸度是A．50ml中加2ml稀硝酸B．50ml中加5ml稀硝酸C．50ml中加l0ml稀硝酸D．50ml中加5ml硝酸E．50ml中加l0ml硝酸6．氯化物检查法中，用以解决供试品溶液带颜色对测定干扰的方法是A．活性炭脱色法B．有机溶剂提取后检查法C．内消色法D．标准液比色法E．改用他法7．BP采用进行铁盐检查的方法是A．古蔡氏法B．硫氰酸盐法C。
巯基醋酸法D．硫代乙酰胺法E．硫化钠法8．采用硫氰酸盐法检查铁盐时，若供试液管与对照液管所呈硫氰酸铁的颜色较浅不便比较时，可采取的措施是A．内消色法B．外消色法C．标准液比色法D．正丁醇提取后比色法E．改用他法9．下列试液中，用作ChP重金属检查法中的显色剂的是A．硫酸铁铵试液B．硫化钠试液C．氰化钾试液D．重铬酸钾试液E．硫酸铜试液10.硫代乙酰胺法检查重金属时，受溶液pH影响较大，适合的pH是A. 11.5B.9.5C.7.5D.3.5E.1.51 1．采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有色需在加硫代乙酰胺前在对照溶液管中加入的是A．过氧化氢溶液B．稀焦糖溶液C．盐酸羟胺溶液D．抗坏血酸E．过硫酸铵12.采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有微量高铁盐存在，需加入的是A．碘试液B．重铬酸钾溶液C．高锰酸钾溶液D．抗坏血酸E．过硫酸铵13.采用炽灼后硫代乙酰胺法检查重金属时，应控制的炽灼温度范围是A. 500 – 600℃B.600 -700℃C.700 - 800℃D. 800一900℃E.900 – l000℃14.乳酸钠溶液中重金属的检查应采用的方法是A．硫代乙酰胺法B．炽灼后硫代乙酰胺法C．古蔡氏法D．硫化钠法E．硫氰酸盐法15. USP收载的砷盐检查法是A．古蔡氏法B．Ag(DDC)法C．次磷酸法E．亚硫酸法D．白田道夫法16. ChP古蔡氏法检查砷盐，加入碘化钾的主要作用是A．将五价的砷还原为砷化氢B．将三价的砷还原为砷化氢C．将五价的砷还原为三价的砷D．将氯化锡还原为氯化亚锡E．将硫还原为硫化氢17.在古蔡氏检砷法中，加入醋酸铅棉花的目的是A．除去硫化氢的影响B．防止瓶内飞沫溅出C．使砷化氢气体上升速度稳定D．使溴化汞试纸呈色均匀E．将五价砷还原为砷化氢18. ChP采用Ag( DDC)法检查砷盐时，为吸收反应中产生的二乙基二硫代氨基甲酸，加入的试剂是A．吡啶B．三乙胺一三氯甲烷C．二氯甲烷D．氢氧他钠E．正丁醇19．ChP检查葡萄糖酸锑钠中的砷盐时，采用的方法是A．古蔡氏法B．Ag(DDC)法C．白田道夫法D．次磷酸法E．亚硫酸法。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
高效液相色谱分析(影响分离的因素与操作条件的选择)PPT课件
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二、分离类型选择
choice of separation types
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三、 HPLC的应用
application of HPLC
1. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 ，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。
12:51:54
• 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故 降低传质阻力是提高柱效主要途径。 • 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。
第三章 高效液相色谱
分析
high performance liquid chromatograph
第四节 影响分离的因素与操
作条件的选择
factors influenced separation and choice of operation condition
一、影响分离的因素
factors influenced separation
二、分离类型的选择
choice of separation types
三、液相色谱的应用
application of HPLC
四、液相制备色谱
preparative liquid chroma分离的因素
factors influenced separation
第五节 离子色谱法
ion chromatograph
第六节 超临界流体色谱
仪器分析课后题答案（第四版）
仪器分析课后题答案（第四版）第⼆章⽓相⾊谱分析1. 当下列参数改变时:(1)柱长缩短,(2)固定相改变,(3)流动相流速增加,(4)相⽐减少,是否会引起分配系数的改变?为什么?答:固定相改变会引起分配系数的改变,因为分配系数只与组分的性质及固定相与流动相的性质有关.所以（1）柱长缩短不会引起分配系数改变（2）固定相改变会引起分配系数改变（3）流动相流速增加不会引起分配系数改变（4）相⽐减少不会引起分配系数改变2.当下列参数改变时: (1)柱长增加,(2)固定相量增加,(3)流动相流速减⼩,(4)相⽐增⼤,是否会引起分配⽐的变化?为什么?答: k=K/b,⽽b=VM/VS ,分配⽐除了与组分,两相的性质,柱温,柱压有关外,还与相⽐有关,⽽与流动相流速,柱长⽆关.故:(1)不变化,(2)增加,(3)不改变,(4)减⼩3．能否根据理论塔板数来判断分离的可能性?为什么?答: 不能,有效塔板数仅表⽰柱效能的⾼低,柱分离能⼒发挥程度的标志,⽽分离的可能性取决于组分在固定相和流动相之间分配系数的差异.4．在⼀根2 m 长的⾊谱柱上,分析⼀个混合物,得到以下数据:苯、甲苯、及⼄苯的保留时间分别为1?20“, 2…2”及3?1“；半峰宽为0.211cm, 0.291cm, 0.409cm ，已知记录纸速为1200mm.h-1,求⾊谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板⾼度。
解：三种组分保留值⽤记录纸上的距离表⽰时为：苯：（1+20/60）×[（1200/10）/60]=2.67cm甲苯：(2+2/60) ×2=4.07cm⼄苯: (3+1/60) ×2=6.03cm甲苯和⼄苯分别为：1083.7,0.18cm; 1204.2,0.17cm5．试述速率⽅程中A, B, C三项的物理意义. H-u 曲线有何⽤途?曲线的形状主要受那些因素的影响?解: A 称为涡流扩散项, B 为分⼦扩散项，C 为传质阻⼒项。
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B t R ，B D g
Dg
T
或Dg
T M
Cl
df 2 Dl
DL
T
HPLC
涡流扩散
流动流动相传质阻力
H = He + Hd + Hs + Hmm + Hsm
分子扩散 固定相传质阻力
滞留流动相传质阻力
1、涡流扩散项He
He＝ A = 2λdp
,dP A H ,n柱 效
2、分子扩散项Hd
二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较
✓相同：兼具分离和分析功能， 均可以在线检测
✓主要差别：分析对象的差别、 流动相的差别、 操作条件差别
GC HPLC
分析对象的差异
能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型
及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% 溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及
高压进样环进样原理
样品瓶置于进样针下方
高压进样环进样原理
进样针穿过垫圈进入瓶中
高压进样环进样原理
注射器抽取所设定的样品体积
高压进样环进样原理
进样针收回
高压进样环进样原理
转入针端口使之并成为流路的一部分
功能的拓展：
﹠进样针的位置可以上下调节； ﹠利用进样程序进行某些柱前衍生化反应 例：氨基酸的衍生化反应
“三明治”式进样可以自动混合 茚三酮衍生，用紫外检测器 邻苯二甲醛衍生，用荧光检测器
四、分离系统
1、柱材料和规格
﹠不锈钢管 ﹠柱管的内径：0.5 ～ 4.6mm ﹠填料粒度：3 ～ 10 μm ﹠柱长度：10 ～ 50 cm
2、色谱柱色谱性能的评价
评价内容：分离效能、对指定溶质的选择型、在不同PH 介质中的稳定性、不同批次但同型号填料间性能的重 现性、适宜的操作压力等。
• 光通量(透过率%)∶ T= I/I0
• 吸光度∶ A = -log(T)= log(I0/I)
• 吸光度 ∶ A = abc
流动池示意图
定波长检测器 紫外检测器种类 可变波长检测器
二极管阵列检测器DAD
第一种类型：固定波长紫外检测器
光源 低压汞灯，发出90%的254nm波长的光 锌灯，发出214nm波长的光 镉灯则为229nm和326nm
经典液相色谱 常压或减压 填料颗粒大，75～600μm 柱效低，2 ～ 50 块/m 分析速度慢，1～20小时 色谱柱只用一次 不能在线检测
高效液相色谱 高压，40~50MPa 填料颗粒小，2 ～ 50μm 柱效高,40000 ~ 60000 块/m 分析速度快，0.05～1.0 h 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
常用的脱气方法有： ①吹氦脱气法：
原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。 特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少 ②加热回流法：脱气效果也比较好 ③抽真空脱气法： 特点：可以一次完成过滤和脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶 剂体系 ④超声波脱气法
简单，但效果不理想
操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大， 峰展宽小）
三、高效液相色谱法的特点
（1）高压：供液压力和进样压力可达5×104kPa （2）高速: 流动相流速加快 （3）高效: 柱效可达3万塔板/米以上。 （4）高灵敏度:10-16～10-9克 （5）选择性高：可以通过流动相的控制来改善分离
性能评价方法：以指定的一组标准溶质为样品，测定它 们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
例：对于反相色谱填料，可以选择一组具有不同极性的 芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯 等作为基本组分，再加以苯酚或苯胺等酸、碱性溶质。
五、检测系统
主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓 度变化，并由工作站记录数据，定性、 定量分析。
往复型泵
缺点： 流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析 柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染 长期运转后，流动相中的某些机械杂质会造成单向阀阻塞或
阀球磨损不能关闭单向阀，使泵不能正常运转
柱塞式往复泵是HPLC中应用广泛，也是最重要的高压 输液泵
双柱塞往复式串联泵示意图
2、恒压泵（气动放大泵）—输出恒定压 力的泵
高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
流动相差别
GC： 流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力
只与固定相作用
流动相差别（续）
HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱
的选择性、改善分离度增加了因素，对分离 起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重 要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为 流动相可以增大分离选择性
特点： 结构紧凑、造价低、操作维修方便、灵敏度高，
适于梯度洗脱 只能对具特征波长有吸收的物质进行检测
第二种类型：可变波长紫外检测器
氘灯 190～600 nm
新发展 ﹠可以 高灵敏度4 波长同时检测 ﹠根据4波长测定得到的吸收值之比判断峰的纯度 ﹠具有DAD检测器的相似功能
第三种类型：光电二极管阵列检测器（DAD）
第三章 高效液相色谱法
第一节 高效液相色谱法的特点
以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和 技术基础上建立的一种液相色谱法 引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型 高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以 及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化
一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较
)
2
W
5.54(
t
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W1 2
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t
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n理
( 1
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k
)2
（二）速率理论
GC：H A B / u C u （填充柱）
或 H B /u C u （毛细管柱）
A 2 dp
A dp
B 2 D m 2 D g C Cm Cs Cg Cl Cl
影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的 互溶性、检测器的种类
四元低压梯度系统
三、进样装置
1、进样器进样 进样前打开流动相泄流阀 用注射器进样 关闭泄流阀，完成一次
2、六通阀进样装置
进样针 一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈
3、自动进样器
工作站按预定程序自动完成取样、 进样、复位、样品管路清洗和样品盘 的移动等所有步骤
第七：响应值随样品组分量的增加而线性增加， 线性范围宽
第八：不破坏样品组分 第九：能对被检测的峰提供定性和定量信息 第十：响应时间快
检测器的种类
• 可变波长紫外－可见光检测器 • 光电二极管阵列检测器 • 示差折光检测器 • 荧光检测器 • 蒸发光散射检测器 • 电导电化学和脉冲安培检测器 • 质谱检测器
高压输液泵分类：恒压泵和恒流泵
1、恒流泵 输出恒定体积流量的流动相 注射型
恒流泵 往复型 双柱塞往复式并联泵 双柱塞往复式串联泵
往复型泵
目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱 塞往复式串联泵
往复型泵
优点：
☺可以在高压下连续以恒定的流量输液 ☺液缸容积很小，柱塞容易密封，造价低 ☺更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱
④可以选择宽波带进行检测，一次就能把所有组分检测 出来
DAD检测器的一些特殊功能： ⅰ.色谱峰的准确定性 ⅱ.进行峰纯度的检验 ⅲ.选择最佳波长 ⅳ.建立光谱库，检索被测样品的光谱
例：山梨酸和苯甲酸部分 分离的色谱峰
a.山梨酸 b.苯甲酸 c.混合物
紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较
普通检测器
固体颗粒，保护色谱高压泵和色
谱柱 • 流动相过滤方法
过滤用膜： 水系和有机
在线过滤
孔径： 0.22µm和
0.45µm
抽真空 过滤
• 流动相脱气的目的 –使色谱泵的输液准确 • 输液均匀准确，并且脉动减小 • 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 –提高检测的性能 • 防止气泡引起的尖峰 • 基线稳定，信噪比增加 • 溶剂的紫外吸收本底降低 –保护色谱柱 • 减少死体积 • 防止填料的氧化
常用的脱气方法（续）
⑤在线真空脱气法 把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过
滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。
二、高压输液系统
高压输液泵性能： ①泵体材料耐化学腐蚀 ②能在高压下连续工作 ③ 输液流量范围宽 ④输出流量稳定、重复性高：流量控 制的精密度应小于1%（最好为0.5% ），重复性 最好为0.5%
单液缸气动放大泵示意图
• 气动放大泵是利用气体为动力源，通过帕 斯卡原理把气体的压力放大成流动相的压 力
3、输液系统的辅助设备 主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组
成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置 4、梯度洗脱装置
梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善 检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术
2、衡量检测器的指标
• 灵敏度∶ S = △R / △Q
–△R是检测器响应值的增量 –△Q是样品量的增量
• 噪音∶ 没有样品时检测器的最大输出信号 • 漂移∶ 检测器在一段时间内响应值的变化 • 线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比 • 最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度 • 信噪比∶S/N
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样
分离
检测
记录
一、贮液和脱气装置
1 储液罐 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料 聚醚酮（PEEK）
容积：0.5~2.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输静压差 注意：密封、过滤