第三章高效液相色谱法A

常用的脱气方法有： ①吹氦脱气法：
原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。 特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少 ②加热回流法：脱气效果也比较好 ③抽真空脱气法： 特点：可以一次完成过滤和脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶 剂体系 ④超声波脱气法
Hale Waihona Puke Baidu简单，但效果不理想
过程的选择性 （6）应用范围广
四、 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
基础
（一）塔板理论
H 理 L / n理
n理
(tR
)2
5.54( tR W1 2
)2
16( tR W
)2
H eff L / neff
neff
16(
t
' R
（一）概述
1、理想的检测器应具备的特性 第一：具有高灵敏度和可预测的响应 第二：对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异 性，适用范围广 第三：温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响 第四：响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱 第五：死体积小，不造成柱外谱带扩展 第六：使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修
单液缸气动放大泵示意图
• 气动放大泵是利用气体为动力源，通过帕 斯卡原理把气体的压力放大成流动相的压 力
3、输液系统的辅助设备 主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组
成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置 4、梯度洗脱装置
梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善 检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术
• 光通量(透过率%)∶ T= I/I0
• 吸光度∶ A = -log(T)= log(I0/I)
• 吸光度 ∶ A = abc
流动池示意图
定波长检测器 紫外检测器种类 可变波长检测器
二极管阵列检测器DAD
第一种类型：固定波长紫外检测器
光源 低压汞灯，发出90%的254nm波长的光 锌灯，发出214nm波长的光 镉灯则为229nm和326nm
固体颗粒，保护色谱高压泵和色
谱柱 • 流动相过滤方法
过滤用膜： 水系和有机
在线过滤
孔径： 0.22µm和
0.45µm
抽真空 过滤
• 流动相脱气的目的 –使色谱泵的输液准确 • 输液均匀准确，并且脉动减小 • 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 –提高检测的性能 • 防止气泡引起的尖峰 • 基线稳定，信噪比增加 • 溶剂的紫外吸收本底降低 –保护色谱柱 • 减少死体积 • 防止填料的氧化
–注意∶最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它 实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、 分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此
（二）紫外检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光或可见 光的选择性吸收
定量基础：比耳定律， AKCL
比耳定律
• 光能量∶
– I0 = 入射光强度 – I = 透过光强度
“三明治”式进样可以自动混合 茚三酮衍生，用紫外检测器 邻苯二甲醛衍生，用荧光检测器
四、分离系统
1、柱材料和规格
﹠不锈钢管 ﹠柱管的内径：0.5 ～ 4.6mm ﹠填料粒度：3 ～ 10 μm ﹠柱长度：10 ～ 50 cm
2、色谱柱色谱性能的评价
评价内容：分离效能、对指定溶质的选择型、在不同PH 介质中的稳定性、不同批次但同型号填料间性能的重 现性、适宜的操作压力等。
Van Deemter方程
H2dpC du D m C D m d m p 2C D sm m dp 2C D sd S2 f u
H A BCu u
分子扩散和传质阻力对板高的贡献
固定相粒度大小对板高的影响
（三）影响谱带展宽的其他因素
柱外效应
第二节 高效液相色谱仪
液相色谱的基本流程图
④可以选择宽波带进行检测，一次就能把所有组分检测 出来
DAD检测器的一些特殊功能： ⅰ.色谱峰的准确定性 ⅱ.进行峰纯度的检验 ⅲ.选择最佳波长 ⅳ.建立光谱库，检索被测样品的光谱
例：山梨酸和苯甲酸部分 分离的色谱峰
a.山梨酸 b.苯甲酸 c.混合物
紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较
普通检测器
特点： 结构紧凑、造价低、操作维修方便、灵敏度高，
适于梯度洗脱 只能对具特征波长有吸收的物质进行检测
第二种类型：可变波长紫外检测器
氘灯 190～600 nm
新发展 ﹠可以 高灵敏度4 波长同时检测 ﹠根据4波长测定得到的吸收值之比判断峰的纯度 ﹠具有DAD检测器的相似功能
第三种类型：光电二极管阵列检测器（DAD）
第三章 高效液相色谱法
第一节 高效液相色谱法的特点
以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和 技术基础上建立的一种液相色谱法 引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型 高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以 及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化
一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较
B t R ，B D g
Dg
T
或Dg
T M
Cl
df 2 Dl
DL
T
HPLC
涡流扩散
流动流动相传质阻力
H = He + Hd + Hs + Hmm + Hsm
分子扩散 固定相传质阻力
滞留流动相传质阻力
1、涡流扩散项He
He＝ A = 2λdp
,dP A H ,n柱 效
2、分子扩散项Hd
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样
分离
检测
记录
一、贮液和脱气装置
1 储液罐 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料 聚醚酮（PEEK）
容积：0.5~2.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输静压差 注意：密封、过滤
2、流动相----过滤、脱气
• 流动相过滤的目的
过滤去除可能存在的微小
高压进样环进样原理
样品瓶置于进样针下方
高压进样环进样原理
进样针穿过垫圈进入瓶中
高压进样环进样原理
注射器抽取所设定的样品体积
高压进样环进样原理
进样针收回
高压进样环进样原理
转入针端口使之并成为流路的一部分
功能的拓展：
﹠进样针的位置可以上下调节； ﹠利用进样程序进行某些柱前衍生化反应 例：氨基酸的衍生化反应
操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大， 峰展宽小）
三、高效液相色谱法的特点
（1）高压：供液压力和进样压力可达5×104kPa （2）高速: 流动相流速加快 （3）高效: 柱效可达3万塔板/米以上。 （4）高灵敏度:10-16～10-9克 （5）选择性高：可以通过流动相的控制来改善分离
样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带 的分子扩散也愈严重。 Dm≈10-5 cm2/s（比在气体中要小4—5个数量 级），所以在液相色谱中，纵向分子扩散项实 际上可以忽略
3、传质阻力项
(1)固定相传质阻力项Hs：
(2)流动相传质阻力项： ①流动的流动相的传质阻力Hmm
②滞留的流动相的传质阻力Hsm
光电二极管阵列检测器
DAD检测器的主要特点：
①可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算 不同波长处的相对吸收比
②可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置 实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长
③在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描， 得到时间—波长—吸收值为坐标的三维图形
DAD检测器的主要特点（续 ）
)
2
W
5.54(
t
' R
)2
W1 2
k
t
' R
t0
neff
n理
( 1
k
k
)2
（二）速率理论
GC：H A B / u C u （填充柱）
或 H B /u C u （毛细管柱）
A 2 dp
A dp
B 2 D m 2 D g C Cm Cs Cg Cl Cl
影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的 互溶性、检测器的种类
四元低压梯度系统
三、进样装置
1、进样器进样 进样前打开流动相泄流阀 用注射器进样 关闭泄流阀，完成一次
2、六通阀进样装置
进样针 一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈
3、自动进样器
工作站按预定程序自动完成取样、 进样、复位、样品管路清洗和样品盘 的移动等所有步骤
性能评价方法：以指定的一组标准溶质为样品，测定它 们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
例：对于反相色谱填料，可以选择一组具有不同极性的 芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯 等作为基本组分，再加以苯酚或苯胺等酸、碱性溶质。
五、检测系统
主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓 度变化，并由工作站记录数据，定性、 定量分析。
二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较
✓相同：兼具分离和分析功能， 均可以在线检测
✓主要差别：分析对象的差别、 流动相的差别、 操作条件差别
GC HPLC
分析对象的差异
能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型
及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% 溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及
光电二极管阵列检测器
（三）荧光检测器（FLD）
• 荧光检测器是利用测量化合物荧光强度，对化 合物进行检测的检测器。
• 在实验条件固定，样品浓度较低时，荧光强度 与样品浓度呈线性关系，因此荧光检测器是浓 度敏感性检测器，可直接用于定量分析
常用的脱气方法（续）
⑤在线真空脱气法 把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过
滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。
二、高压输液系统
高压输液泵性能： ①泵体材料耐化学腐蚀 ②能在高压下连续工作 ③ 输液流量范围宽 ④输出流量稳定、重复性高：流量控 制的精密度应小于1%（最好为0.5% ），重复性 最好为0.5%
经典液相色谱 常压或减压 填料颗粒大，75～600μm 柱效低，2 ～ 50 块/m 分析速度慢，1～20小时 色谱柱只用一次 不能在线检测
高效液相色谱 高压，40~50MPa 填料颗粒小，2 ～ 50μm 柱效高,40000 ~ 60000 块/m 分析速度快，0.05～1.0 h 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
流动相差别
GC： 流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力
只与固定相作用
流动相差别（续）
HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱
的选择性、改善分离度增加了因素，对分离 起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重 要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为 流动相可以增大分离选择性
高压输液泵分类：恒压泵和恒流泵
1、恒流泵 输出恒定体积流量的流动相 注射型
恒流泵 往复型 双柱塞往复式并联泵 双柱塞往复式串联泵
往复型泵
目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱 塞往复式串联泵
往复型泵
优点：
☺可以在高压下连续以恒定的流量输液 ☺液缸容积很小，柱塞容易密封，造价低 ☺更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱
2、衡量检测器的指标
• 灵敏度∶ S = △R / △Q
–△R是检测器响应值的增量 –△Q是样品量的增量
• 噪音∶ 没有样品时检测器的最大输出信号 • 漂移∶ 检测器在一段时间内响应值的变化 • 线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比 • 最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度 • 信噪比∶S/N
第七：响应值随样品组分量的增加而线性增加， 线性范围宽
第八：不破坏样品组分 第九：能对被检测的峰提供定性和定量信息 第十：响应时间快
检测器的种类
• 可变波长紫外－可见光检测器 • 光电二极管阵列检测器 • 示差折光检测器 • 荧光检测器 • 蒸发光散射检测器 • 电导电化学和脉冲安培检测器 • 质谱检测器
往复型泵
缺点： 流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析 柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染 长期运转后，流动相中的某些机械杂质会造成单向阀阻塞或
阀球磨损不能关闭单向阀，使泵不能正常运转
柱塞式往复泵是HPLC中应用广泛，也是最重要的高压 输液泵
双柱塞往复式串联泵示意图
2、恒压泵（气动放大泵）—输出恒定压 力的泵
优点：
☺能以比较简单的方式建立高压并输出无脉动
的恒压流动相液流
☺适合和折光示差检测器配合使用
☺可以利用改变气源压力的方法来调节载液流
速
缺点：
不能输出恒定流量的流动相 色谱峰的重复保留时间差 不能获得可靠的定性结果
液缸体积大（约70ml)，更换载液时操作不便
目前恒压泵主要用于色谱柱的制备，配合装柱用的 匀浆装柱机，可以快速建立所需的高压输出