高效液相色谱法及其在中药分析中的应用

Column:Inertsil ODS-3V, 5µ , 150 x 4.6mm Mobile Phase: (50:50) Methanol:Water Flow Rate: 1.0mL/min
Detector:UV at 365
中药指纹谱分析
20源自文库7/8/1
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2005版HPLC方法应用
有效成分\特征成分含量测定 多成分指标含量测定 多种检测器应用
安培检测器 电导检测器
库仑检测器
介电常数检测器 极谱检测器
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工作站： 完成数据采集和对仪器的控制。
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超高效液相色谱仪（ UPLC）
超高效液相色谱是分离科学 中的一个全新类别，它给实 验室带来了新奇而强大的能 力。UPLC™借助于HPLC的 理论及原理，涵盖了小颗粒 填料、非常低系统体积及快 速检测手段等全新技术，增 加了分析的通量、灵敏度及 色谱峰容量。
高效液相色谱法 及其在中药分析中的应用
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色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
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液相色谱的分类
按溶质在分离过程中的原理：
•
• • • •
吸附色谱
分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
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液相色谱的分类 按色谱固定相的形式：
522
2333 390 315
高效液相色谱法附录修订内容(2005版)
修订内容和特点： 明确了 HPLC 方法的几种分离机制，为分类应 用提供了基础； 明确了数据处理系统（色谱工作站）作为色 谱信号记录; 以较大篇幅增加了色谱柱、检测器、流动相 的内容，适应快速发展的、日趋成熟的 HPLC 技术的要求。
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进样系统包括手动进样和自动进样
无论手动进样还是自动进样，都要通过
六通阀。六通阀进样是高压系统的需要， 既不影响系统的正常运行又能够让样品
进到系统中去。
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高效液相色谱仪器——进样器
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柱系统包括色谱柱和柱温箱
反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱， 也就是C18柱。 柱温箱的温度控制要求比较精确，因为 流体的粘度受温度的影响较大。
对仪器的一般要求(2000版)
所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和 流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱 柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基 硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之， 氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂， 用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂，用 于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温， 检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分 光光度法(附录Ⅴ A)项下对溶剂的要求。
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有效成分\特征成分含量测定
紫草 前胡 续断 射干 丹参 地肤子 甘草 玄参 荷叶 荆芥 胡黄连 虎杖 槐角
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β,β'-二苯酰基阿卡宁 白花前胡甲素 川续断皂苷 VI 次野鸢尾黄素 丹酚酸 B 地肤子皂苷 Ic 甘草苷 哈巴俄苷 荷叶碱 胡薄荷酮 胡黄连苷 I\胡黄连苷 II 虎杖苷 槐角苷
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2000版
2005版
高效液相色谱法是用高压 高效液相色谱法系采用高 输液泵将具有不同极性的 压输液泵将规定的流动相 单一溶剂或不同比例的混 泵入装有填充剂的色谱柱 合溶剂、缓冲液等流动相 进行分离测定的色谱方法。 泵入装有固定相的色谱柱， 注入的供试品，由流动相 经进样阀注入供试品，由 带入柱内，各成分在柱内 流动相带入柱内，在柱内 被分离，并依次进入检测 各成分被分离后，依次进 器，由记录仪、积分仪或 入检测器，色谱信号由记 数据处理系统记录色谱信 录仪或积分仪记录。 号。 高效液相色谱法的主要分 离机制有吸附、分配、离 子交换和排阻作用。
DAD检测器3D图
示差折光检测器（refractive index detector RID）： 溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分 溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积 之和。 RID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。
RID不能用于梯度洗脱。
蒸发光散射检测器
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电学和电化学检测器：
杂质或有关 物质检查
添加物或有害残留物质的检测
Organophosphate Pesticides Peak Identification 1. Methyl Parathion 2. Dichlorvos 3. Ethoprophos 4. Azinphos
Column:Alltima HP EPS C18, 5µ , 150 x 4.6mm
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液相色谱检测器
测量原理不同分类： •光学性质检测器
•电学和电化学性质检测器
•热学性质检测器
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光学性质检测器： 紫外－可见光检测器 示差折光检测器
荧光检测器
蒸发光散射检测器 化学发光检测器
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高效液相色谱仪器——检测器
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紫外吸收检测器有三种类型：
三七 人参 西洋参 红参 大黄
Rg1, Rb1, R1 Rg1, Re, Rb1 Rg1, Re, Rb1 Rg1\Re\Rb1 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大 黄酚、大黄素甲醚
金银花 木香 木通
绿原酸 木香烃内酯、去氢木香内酯 齐墩果酸、常春藤皂苷元
ELSD检测方法应用
知母 薏苡仁 黄芪 蜜黄芪 银杏叶 菝契皂甘元 甘油三油酸酯 黄芪甲苷 黄芪甲苷 萜类内酯
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Ginkgolides
Peak Identification 1. Ginkgolide J 2. Ginkgolide C 3. Ginkgolide A 4. Ginkgolide B
Column:Nucleosil C18, 5µ m, 250 x 2.1mm Part No. C-6000B Mobile Phase: Water:Methanol:Tetrahydrofuran (70:20:10) Flow Rate: 0.2mL/min Detector:500 ELSD
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有效成分\特征成分含量测定
山楂叶 莲子心 路路通 红花 川射干 肉苁蓉 西红花 重楼 两头尖 刺五加 苦地丁 金丝桃苷 莲心碱 路路通酸 羟基红花黄色素 A 射干苷 松果菊苷， 西红花苷-I，西红花苷-II 重楼皂苷 I\重楼皂苷 II 竹节香附素 A 紫丁香苷 紫堇灵
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多成分指标 含量测定
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高效液相色谱——固定相 化学键合相硅胶
octadecyl octyl cyanopropyl Si-[CH2]17-CH3 Si-[CH2]7-CH3 Si-[CH2]3-CN C18 C8 CN
aminopropyl
Si-[CH2]3-NH2
NH2
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固定相的其他性能
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定 254nm或280nm紫外光。 可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光
光二极管阵列检测器photo－diode－array detector（PDAD，PDA, DAD）：钨灯和氘灯组合 光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外 波长上的光。 PDA 可以辅助定性。
银杏叶提取物 萜类内酯
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银杏叶提取物中银杏酸的限量检查
含量
样品
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6
以总酸计ppm
0.4 0.2 0.4 3.8 27 1667
以银杏酸13：0计ppm
0.4 0.2 0.4 3.8 28 1662
样品7
样品8 样品9 样品10
524
2339 392 316
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有效成分、指标成分的检测
人参皂苷的检测
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Flavones, Flavanones, and Flavanone Glycosides Peak Identification 1. Naringin 2. Neohesperidin 3. Myricetin 4. Quercetin 5. Naringenin 6. Kaempferol
•
•
平板色谱（平面色谱）
柱色谱
按分离的压力
• • •
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高压液相色谱（高效液相色谱） 中压液相色谱 常压液相色谱
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H－dp关系图
液固色谱法
一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。液固色 谱法的固定相一般为固体吸附剂，常用的是： 碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭等。 其中硅胶最为常用。 吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可获得最 佳的分离，而对强极性或离子型的样品，有时 会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。
2017/8/1
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高效液相色谱法在药典中的应用
项目 2000版 2005版
含量测定
109
527
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HPLC与TLC比较(2005版)
含量测定 TLC-SC HPLC 175 352
药材和提取物 15 中成药 35
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HPLC在中药质量分析和检测中的应用
有效成分、指标成分的检测； 杂质或有关物质检查； 添加物或有害残留物质的检测； 中药指纹谱分析
Column:Alltima C18, 3µ m, 100x4.6mm Mobile Phase: A: 50mM Potassium Phosphate, pH 2.5 B: ACN Gradient:(Time,%B)(0,20)(15,40) Flow Rate: 1.0mL/min Detector:UV at 280nm
载体的形状 球形 无定形 粒径 3~10μm, 1.7~2.5μm 孔径 <150Å 分析分子量 <2000的化合物;>300Å 分 析分子量>2000的化合物 表面积 键合基团的表面覆盖度 含碳量
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一般认为键合相色谱的机理分配色谱机理，
也有人认为它是吸附色谱机理，其实应该 是有两种成分在里面，现在又有疏溶剂理 论等机理的提出。
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基本原理：
吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明 存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相 分子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争， 同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团
之间液也存在竞争。竞争的综合结果就是形
成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。
2017/8/1 7
用一个式子表示如下：
Mobile Phase: (40:60) methanol:water Flow Rate: 1.0 mL/min
Detector:UV at 214nm
添加物或有害残留物质的检测
Aflatoxin Standards
Peak Identification 1. Aflatoxin G2 (0.06 µ g/mL) 2. Aflatoxin G1 (0.20 µ g/mL) 3. Aflatoxin B2 (0.06 µ g/mL) 4. Aflatoxin B1 (0.20 µ g/mL)
X m nMs X s nMm
吸附
解吸
X表示溶质分子，下标m为流动相，s为固定相 M表示流动相分子，下标m为流动相，s为固定相
n为被溶质分子取代的流动相分子数目
2017/8/1
8
键合相液相色谱
键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应 把官能基团键合到表面上，解决固定相流 失的问题。 正相色谱：流动相极性比固定相极性小 反相色谱：流动相极性比固定相极性大
存放流动相的容器一定要惰性的，并且 有机溶剂要避光。 输液泵要求流量平稳,可以调节的流量 范围宽，耐高压。
一般是柱塞往复泵。
2017/8/1
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流动相的混合输入和洗脱方式
离线混合 配制 滤过 脱气
在线混合 低压在线混合 高压在线混合 洗脱 等度洗脱 梯度洗脱
2017/8/1
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高效液相色谱仪器——泵系统
2017/8/1 14
高效液相色谱仪器
1. 储存和输送液体设备 2. 进样系统 3. 柱系统 4. 检测器
5. 控制和数据处理系统
选择流动相的原则： •保持色谱柱的稳定性 •化学惰性
•适合所用的检测器
•对样品有一定的溶解能力
•清洗、更换方便、毒性小
•沸点、粘度等物理性质合适
反相色谱最常用的流动相： 水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。 水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大 水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。