化学发光免疫标记分析技术(基本原理 )
化学发光免疫分析
糖尿病
Albumin C-peptide Insulin
唐氏筛查
PAPP-A free βHCG HCG＋β AFP
心肌标志
骨标志
肝纤维
CK-MB
ß-Crosslaps
LN
Digoxin
25-(OH) Vit. D
HA
Digitoxin
Intact PTH
PIIINP
Myoglobin
Intact PTH
试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由
于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一 个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化 学发光相比，有效期长可以降低使用成本， 利于推广应用。
梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
3 化学发光免疫分析的优越性
➢ 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
种类
方法
检测原理
酶联免疫
酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果
免疫 化学发光
诊断
将抗原抗体同样本结合，由磁珠捕捉反应物，加入 发光促进剂加大反应发光速度与强度，进而诊断
根据镧系元素螯合物发光特点，用时间分辨技术测 时间分辨荧光
量荧光，检测波长和时间两个参数进行信号分辨
分子 诊断
PCR 基因芯片
DNA高温变成单链，低温互补配对链合成
激发态ν
的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出
光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样
品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测
能量
h.ν
物质的含量。
基态ν0 梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
化学发光的原理
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) ,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。
化学发光免疫分析仪包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。
化学发光免疫分析仪包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。
化学发光免疫分析仪器中核心探测器件为光电倍增管（PMT），由单光子检测并传输至放大器，并加高压电流放大，放大器将模拟电流转化为数字电流，数字电流将发光信号由R232数据线传输给电脑并加以计算，得出临床结果。
化学发光标记免疫分析法化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) ,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。
常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) ,是有效的发光标记物[ 3 ] , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光(见图1)。
吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法 ,大分子抗原则采用夹心法 , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。
化学发光免疫分析
化学发光免疫检测技术临床应用：
1、甲状腺功能类：
T3 、T4、THS、FT3、
FT4、rT3、TG、T-PO 新生儿筛查：T4 sTSH
2、性腺激素类：
HCG、ß-HCG、FSH、
LH、E2、E3、PRL、P、 T、GH等
3、肿瘤检测：
CEA、AFP、Fe、PSA、
CA125、CA153、CA199 CA50、CA211、CA724
肌钙蛋白I的临床意义
• 特异性强、确诊率高
诊断急性心肌梗塞特异性 > 98 % 对极轻微的心肌创伤都能检出 体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断
•ห้องสมุดไป่ตู้灵敏度低
急性心梗发病后6 h才出现，应与肌红 蛋白一同使用
肌钙蛋白I升高即可确诊为急性 心肌梗塞，及时得到治疗
胸痛
肌钙蛋白I
> 8h
+
急性心梗 随访
4、心血管：CK-MB、BNP、Tn-I、 Myoglobin 5、贫血类：铁蛋白、Vite B12、叶酸 6、药物浓度：地高辛、洋地黄、托普霉素 可马西平、苯巴比妥、等 7、糖尿病及代谢：胰岛素、C-肽、PTH 8、过敏源类：过敏源筛选、总过敏源 9、传染病：肝炎系列、风疹、弓形体 10、其他：皮质醇、还有很多待开发项目。
心血管系统:
如何能
更快 更准确
更全面的
诊断AMI
诊断急性心肌梗塞有一定难度
• 一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入 院时心电图并不典型。 时心电图并不能典型归类
•
病人再发梗塞诊断困难
导致不能及时诊断AMI 延误及时治疗、护理
•
临床需要
尽早准确诊断AMI方法
T
肌肉组织
化学发光免疫标记分析技术基本原理
化学发光免疫标记分析技术基本原理化学发光免疫标记分析技术主要包括两个步骤：标记物制备和检测过程。
在标记物制备阶段，通常使用特定的荧光染料或荧光标记物来与待检测物质进行反应，并形成稳定的标记物-待检测物质复合物。
而在检测过程中，通过光学系统激发和采集标记物产生的化学发光信号，从而获得待检测物质的信息。
1.标记物制备：在化学发光免疫标记分析技术中，常用的标记物包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物的原理是将特定酶与待检测物质结合，并通过酶反应产生化学发光信号。
例如，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
而荧光标记物的原理则是将特定荧光染料或荧光物质与待检测物质发生物理或化学反应，从而产生荧光信号。
荧光标记物具有高灵敏度、高分辨率和多颜色检测等优点。
2.检测过程：在化学发光免疫标记分析技术中，通常采用放射性同位素或者化学合成的光感受物质作为化学发光底物。
这些光感受物质在一定条件下与酶标记物或荧光标记物发生反应，产生化学发光信号。
这种化学发光反应通常是一种酶催化反应，通过酶的催化作用将底物转化为高能态的中间产物，进而使中间产物与发光底物反应产生化学发光。
1.样品制备：将待检测的样品进行适当处理和净化，以去除干扰物并保留待测物质。
2.标记物制备：选择适当的酶标记物或荧光标记物，并将其与待检测物质结合，形成稳定的复合物。
3.反应过程：将标记物与样品中的待测物质进行反应，形成标记物-待检测物质复合物。
4.分离与清洁：根据实验需求，通过特定的分离技术分离出标记物-待检测物质复合物，并清洁除去未结合的杂质。
5.光学系统激发和采集信号：将分离出的标记物-待检测物质复合物放置于化学发光仪或荧光显微镜等设备中，通过特定的光源激发标记物产生的化学发光或荧光信号，并通过相应的光学系统采集和记录信号。
6.数据分析和结果解读：通过对采集得到的化学发光或荧光信号进行数据处理和分析，根据标定曲线或标准样品，计算出待检测物质的含量或其它相关信息，并根据实验目的对结果进行解读。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
优化技术操作流程，降低对专业人员的依赖，提高检测的便捷性和 普及性。
开发新型标记物
研究开发更多种类的化学发光标记物，拓展该技术的应用范围，满足 更多不同检测需求。
感谢您的观看
THANKS
放射免疫标记技术
利用放射性核素标记抗体或抗原，通 过放射性信号检测，常用的有放射免 疫分析法。
化学发光免疫标记技术
利用化学发光物质标记抗体或抗原， 通过化学发光信号检测，常用的有化 学发光免疫分析法。
免疫标记技术的原理
抗原-抗体反应
信号放大
免疫标记技术的基本原理是抗原 和抗体之间的特异性结合反应。 标记物（抗体或抗原）与待测样 本中的目标抗原或抗体结合，形 成标记的抗原-抗体复合物。
02
化学发光反应原理
化学发光反应的分类
偶合反应
01
通过两个化学反应的偶合，将化学能转变为光能。
氧化还原反应
02
通过电子的得失，将化学能转变为光能。
化学发光复合反应
03
通过化学反应将能量传递给另一物质，使其激发并发出光子。
化学发光反应的机制
激发态的形成
反应物吸收能量后跃迁至激发态。
能量传递与光子的发射
抗体标记
抗体选择
选择与目标抗原特异性结合的抗体，确保抗 体的纯度和特异性。
抗体标记技术
采用荧光染料、酶、同位素等标记抗体，以 便后续检测和信号放大。
标记效率与质量控制
对标记后的抗体进行质量评估和控制，确保 标记效率和稳定性。
免疫反应
1 2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加样
将待测样本、标记抗体和抗原加入反应体系中， 进行免疫反应。
激发态的反应物将能量传递给另一物质，使其跃迁至激发态并释放 光子。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术
第31页
化学发光免疫分析技术
第4页
是当前世界公认先进标识免疫测定技术，化学发光免
疫分析技术含有高度准确性和特异性，成为检验方法中最 为主要技术之一。化学发光免疫分析技术作为疾病诊疗主 要伎俩已被广泛用于机体免疫功效、传染性疾病、内分泌 功效、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功效等方面体外诊疗 分析技术
第7页
• 分析方法简便快速
• 结果稳定、误差小
• 样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免去了各种可能原因（光源稳定性、光 散射、光波选择器等）给分析带来影响，使分析结果灵敏稳定可靠。
• 安全性好及使用期长
• 免去了使用放射性物质。到当前为止，还未发觉其危害性；试剂稳定，保留期可达一 年。
T3降低： ⑴仅于较重甲状腺功效减退病人，T3和T4均下降，轻型甲减T3 不一定下降； ⑵重症全身性疾病状态或慢性病变可造成T3下降，多见 于慢性肾功效不全、慢性心功效不全、糖尿病、心梗等疾病患者。
化学发光免疫分析技术
第33页
游离甲状腺素（FT4）游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）
• FT3和FT4分别为T3和T4在血清中未与蛋白结合部分，其不 受血清中TBG影响，直接反应甲状腺功效状态，其敏感性 和特异性均高于T3和T4
化学发光免疫分析技术
第15页
㈠ 辣根过氧化物酶标识化学发光免疫分析
该分析系统采取辣根过氧化物酶（HRP）标 识抗体(或抗原)，在与反应体系中待测标本 和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被 抗体-待测抗原-酶（HRP）标识抗体复合物， 这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增 强剂使产生化学发光。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
吖啶酯化学发光系统-CH3-HOO-C=0-OH-光子+C02+-R
碱性磷酸酶化学发光系统-金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统-OCH3-AP-0P032-碱性磷 酶及其衍生物的化-·光子477nm
化学发光的检测类型-化学发光按化学反应类型分为：-◆直接化学发光（非酶促化学发光-吖啶酯系统-●-异鲁米诺 统-◆间接化学发光（酶促化学发光-·辣根过氧化物酶一鲁米诺系统（HRP系统-碱性磷酸酶一金刚烷系统AP系统 其它-电化学发光
板式化学发光-,适合流行病调查、疾病预防与控制、-体检中心，以及医院血站等大样本检-测项目的使用（比如HI 、TP、HCV和-乙肝两对半等。-通常采用96孔白色不透明微孔板进行包-被，不方便随到随测和医院急诊；-对 定量检测需要做标准曲线。-◆-国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光-采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；-可以随到随测，适用于医院急诊；-定量检测的标准曲线存 在试剂条形码中，-可在2-4周内直接使用。-国外厂家全部是管式化学发光系统
间接化学发光-以碱性磷酸酶系统为例-洗涤清除团-间接化学发光：用参与发-◆》回+-光反应的酶来标记抗原或体，免疫反应后，加入-抗体包被-的磁珠-标记抗体-双抗体夹心复合物-发光底物，测定发光体系-的发光强度来进 抗原或-◆可茶-抗体的检测。-AMPPD-AMPD发光-两大反应体系：-辣根过氧化物酶-HRP系统：氧化还 反应，稳定性差-·源德、科美、安图-碱性磷酸酶（AP系统：水解反应，灵敏度较高-●-贝克曼：Access1 Access2,DXI600、DXI800-西门子：mmulite:1000,Immulite2000-达 生物：AULIN200
免疫学检测-◆-免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、-抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手 及分子-生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：-抗原抗体的检测技术-免疫细胞的检测-细胞因子的检测-免疫 关基因分析-免疫标记技术-免疫PCRIM-PCR技术-杂交瘤技术与T细胞克隆技术
磁微粒化学发光
一、化学发光免疫分析技术概述化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)兴起于上世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，应用范围十分广泛。
该技术近10年发展迅猛，是目前推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级。
二、化学发光免疫分析技术原理在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光技术。
其基本原理是免疫反应中的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。
这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。
利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
化学发光免疫分析技术常采用双抗体夹心法、竞争法及间接法等反应模式，如图1-3所示。
图1.双抗体夹心法图2.竞争法图3.间接法三、磁微粒在免疫学检测中的应用磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。
由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团（如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等）将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。
传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。
四、磁微粒化学发光免疫分析技术介绍磁微粒化学发光免疫分析技术综合了磁微粒载体技术和化学发光免疫检测技术，使测量结果更准确，更稳定。
●磁微粒化学发光--双抗体夹心法：待测抗原同荧光素标记的抗体及酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）在近十年来得到了很大发展，与微离子发光酶免疫分析(microparticle luminescence immunoassay, MLIA)、生物发光免疫分析(bioluminescence immunoassay, BLIA)、增强化学发光分析(enhanced chemiluminescence, EC)和电化学发光分析(electrochemical luminescence, ECL)等相比，以其灵敏度高（可达10-18mol）、检测速度快、操作简便、所用试剂对人体无危害的优点，成为非放射性免疫分析技术中最具有发展前途的方法之一。
（一）化学发光免疫分析的基本原理化学发光指化学反应引起的发光现象，当物质吸收化学反应过程中释放的化学能之后，能使自身分子受激发而发光；如在生物体中产生此种能源来自生物活体的发光现象，称为生物发光；若产生发光信号的能量来源于电激发，如从多环芳烃的自由基阴离子上除去一个电子，往往产生激发状态的中间物质，当其回到基态时，将产生光辐射，此种发光称为电化学发光。
化学发光反应所发出的光的强度依赖于化学发光反应的速度，而反应速度又依赖于反应物的浓度。
因此，通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度，从而进行物质的定性和定量分析。
化学发光与荧光的根本区别是形成激发态分子的激发能源不同。
荧光是发光物质吸收了激发光后使分子产生发射光，化学发光是化学反应过程中所产生的化学能使分子激发产生的发射光。
因此，化学发光反应中反应过程必须产生足够的激发能是产生发光效应的重要条件。
（二）化学发光兔疫分析中的标记物质化学发光免疫分析所使用的标记物根据其参与的化学反应不同，可分为三类：①直接参与发光反应的标记物；②以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物；③以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。
例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。
(完整版)化学发光免疫分析技术原理简介(精)
化学发光免疫分析技术原理简介20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查.1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。
近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。
1996 年推出的电化学发光免疫技术,在反应原理上又具有一些新的特点。
这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。
一、化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。
在CLIA中，主要有两个部分,即免疫反应系统和化学发光系统。
免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺（isolu—minol) 、金刚烷( AMPPD）及吖啶酯（ AE）等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。
将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析），经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。
亦可将氧化剂（如碱性磷酸酶等）或催化剂标记于抗原或抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应,其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。
发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短,仅需30 — 60min 即可。
试剂货架寿命长，稳定性好，具有大规模自动化测试的功能。
这项技术发展很快，已有许多厂商生产各具特色的测定仪器与配套试剂。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
04
化学发光免疫标记分析流程
样本准备
01
02
03
样本采集
采集待检测样本，如血液、 尿液等生物样本。
样本处理
对样本进行离心、过滤等 处理，以去除杂质和不必 要的成分。
样本标记
将待检测的抗原或抗体与 荧光物质、酶等标记物结 合，以便后续检测。
加样与反应
加样
将处理后的样本加入化学 发光免疫分析的反应体系 中。
应用领域
临床诊断
环境监测
用于检测肿瘤标志物、激素、传染病 标志物等，为疾病的早期诊断、病情 监测和预后评估提供有力支持。
用于检测环境中的有害物质，如重金 属、有机污染物等，为环境保护和公 共卫生提供技术支持。
生物医药
用于药物研发、药代动力学研究、蛋 白质组学和基因组学分析等领域，加 速新药研发和生物医学研究进程。
提高特异性
针对不同目标分子开发更特异的标记物和探针，提高检测的准确性和 可靠性。
多指标检测
发展多指标联检技术，实现多种生物分子的同时检测，提高检测效率 和应用范围。
THANKS
感谢观看
该技术涉及多个步骤，操作相对 复杂，需要专业人员操作和经验 积累。
化学发光反应过程中可能产生有 害的化学物质，需要采取相应的 安全措施。
技术改进与发展方向
降低成本
通过研发更经济的试剂和仪器，降低化学发光免疫标记技术的成本， 使其更广泛地应用于临床和科研领域。
简化操作
优化试剂和仪器设计，简化操作流程，提高检测效率，降低对专业人 员的依赖。
化学发光反应的能量来源
化学发光反应的能量来源主要是化学能，即通过化学反应释 放的能量。
在化学发光免疫标记分析技术中，通常使用化学能作为能量 来源，通过特定的化学反应激发发光物质，使其发出可见光 。
《化学发光免疫技术》课件
利用酶催化反应放大信号，将化学发光物质作为底物，通过测量发光强度来检测 目标分析物。
详细描述
酶促化学发光免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与目标分析物结合后，通过酶催 化反应放大信号，使化学发光物质的生成量大大增加，再通过测量发光强度来检 测目标分析物。
电化学发光免疫分析
总结词
利用电化学反应产生激发态的化学发光物质，通过测量发光 强度来检测目标分析物。
直接化学发光免疫分析
总结词
直接利用化学发光物质作为标记物，与抗体或抗原结合，通过测量发光强度来 检测目标分析物。
详细描述
直接化学发光免疫分析中，化学发光物质直接与抗体或抗原结合，形成复合物 ，当激发时，产生光子并释放出来，通过光电倍增管等设备测量发光强度，从 而确定目标分析物的浓度。
酶促化学发光免疫分析
特点
高灵敏度、高特异性、操作简便 、检测速度快、可自动化等。
化学发光免疫技术的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测肿瘤标志物、激 素、病毒抗原抗体等。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留等有害物质 。
环境监测
用于检测水体中的重金属 离子、有机污染物等有害 物质。
化学发光免疫技术的发展历程
《化学发光免疫技术》 ppt课件
CATALOGUE
目 录
• 化学发光免疫技术概述 • 化学发光免疫技术的原理 • 化学发光免疫技术的分类 • 化学发光免疫技术的优缺点 • 化学发光免疫技术的应用实例
01
CATALOGUE
化学发光免疫技术概述
定义与特点
定义
化学发光免疫技术是一种利用化 学发光物质和免疫反应相结合， 对生物体内微量物质进行定性和 定量检测的技术。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，CLA）是一种利用化学发光原理检测生物分子的技术。
化学发光是指在一定条件下，某些物质能够通过化学反应，产生电子激发，从而在较高的能级上积累能量，最终能通过放射电磁波而发光的现象。
在CLA中，生物分子（如蛋白质、细胞、激素等）与特异性抗体结合后，通过化学发光原理检测分析生物样本中的目标分子。
CLA技术具有非常高的敏感度、专一性和准确性，被广泛应用于学术研究、临床诊断、环境监测和食品安全等领域。
CLA技术的原理CLA技术主要利用化学发光原理，通过测定分子之间的化学反应发生前后所产生的能量变化以及电子跃迁发光的特性，从而进行分析定量。
其基本原理是：利用亲和层析法、固相抗体法、免疫层析法或酶联免疫吸附法等方法，将特异性的抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微球、硅胶等）上形成抗体-抗原复合物；再将待测样品加入反应体系中，与载体上的抗体结合，形成生物活性复合物；接下来，加入发光底物，在过氧化物酶（POD）或碱性磷酸酶（ALP）的催化下，在化学反应的作用下，引发发光反应，利用光学检测仪器测定发光值，并与标准品进行比较，计算出待测样品中抗原的浓度。
CLA技术的优势CLA技术作为一种高灵敏、高稳定、高特异性的检测方法，具有以下优势：1. 高灵敏度：CLA技术的灵敏度高于其他检测方法，能够检测到极低浓度的生物分子，特别是针对低丰度蛋白质、代谢产物、激素或其他生物标志物，其敏感度更是达到了pg/mL 级别。
2. 高特异性：CLA技术具有极高的特异性，可以区分目标分子和其他非靶分子，降低了假阳性和假阴性的风险，有利于准确判断样本中的目标分子。
3. 高通量：CLA技术可以进行高通量检测，同时检测多个样品，提高了检测效率和样本处理量。
4. 稳定可靠：CLA技术执行简便，无需高端仪器和特殊要求，检测结果稳定可靠，不受样品污染和干扰的影响。
化学发光法产品基本原理及其它公司情况
直接化学发光
发光剂不需要酶的催化作用，在发光条件下直 接参与发光反应。一般在化学结构上有产生发 光的特有基团，且可直接标记抗原或抗体，如 吖啶酯 等
第一部分
化学发光简介
化学发光效率
一个化学发光分子的发光效率可以表示为化学发光的量子产率（ ΦCL ），用以描述每摩尔反应物 辐射出的光子量，量子产率为1（100 %）意味着每一个反应物分子将产生1个光子， ΦCL 是一个有 三个基本参数的函数，表示为 ΦCL =ΦCE ∙ ΦEM (1)
直接化学发光
A + B C*, C* C + h
间接化学发光
A + B C* + D, C* C + h C* + D C + D*, D* D* + h
第一部分
化学发光简介
化学发光分类
（蛋白质）
（EDC）
‐
O 蛋白质‐C‐OH + R‐N=C=N‐R’ =
H R‐N‐C=N‐R’
L-NH2 (发光剂)
O O 蛋白质‐C‐NH‐L + R‐NH‐C‐NH‐R’ = =
‐
C‐O‐蛋白质 O
（蛋白质发光标记物）
=
第三部分
化学发光剂标记技术
重氮盐偶联法(又称重氮化法)-直接偶联
第二部分
化学发光免疫分析类型
直接化学发光免疫分析
通常由吖啶酯直接标记抗体 ( 抗原 ) ，与待测标 本中相应的抗原 ( 抗体 ) 发生免疫反应后，形成 固相包被抗体 ‐ 待测抗原 ‐ 吖啶酯标记抗体复合 物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成 碱性环境，吖啶酯便可分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内 所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原 的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原 的含量。 发光
化学发光法技术概要
化学发光法技术概要 及自动化免疫分析仪 技术要点
科华生物研发中心光免小组
2010.7.14
化学发光法反应基本原理
碱性磷酸酶（AP）及发光底物
RLUs值范围
板管式式问发发题光 光范 范：围 围底10,-物0100空0,0-02白00,,00是0000否,R0L0需U0Rs要LU扣s 除？
分辨率要求
对于测定不同浓度的标本，至少在试剂盒标准曲 线范围内能明显区分两者的RLUs。
市场上主要全自动仪器机型及应用（1）
问题：如何确定磁吸 时间？
磁珠
基本材质：Fe3O4/Fe2O3，褐色磁性物质 直径大小：1μm左右 磁珠类型：
分为氨基磁珠、羧基磁珠、苯甲磺酰基磁珠和链霉 亲和素磁珠等四种磁珠 磁珠特性： 不同供应商的不同类型磁珠，亲水性不同，在溶液 中的状态也不同，所需的磁吸时间也不同。磁吸时 间过短，会造成丢磁；磁吸时间过长，会造成磁珠 聚集，不宜分散。
样本+试剂1（或试剂1+试剂2），37℃孵育5－ 30分钟；
洗涤3-5次； 加入发光底物，5-15分钟检测。
全自动仪器实验流程要求（2）
主要实验流程（2）——一步半法
样本+试剂1（或试剂1+试剂2），37℃孵育5－ 30分钟；
加入试剂3， 37℃孵育5－30分钟； 洗涤3-5次； 加入发光底物， 5-15分钟检测。
各种全自动仪器主要技术参数
HCG Axsym Architect i2000 Architect ci8200 ADVIA Centaur Access Access2 Vidas Dimension Xpand Dimension RXL Immulite Immulite2000 Vitros Elecsys 2010 Elecsys 1010
磁微粒化学发光
一、化学发光免疫分析技术概述化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)兴起于上世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，应用范围十分广泛。
该技术近10年发展迅猛，是目前推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级。
二、化学发光免疫分析技术原理在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光技术。
其基本原理是免疫反应中的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。
这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。
利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
化学发光免疫分析技术常采用双抗体夹心法、竞争法及间接法等反应模式，如图1-3所示。
图1.双抗体夹心法图2.竞争法图3.间接法三、磁微粒在免疫学检测中的应用磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。
由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团（如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等）将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。
传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。
四、磁微粒化学发光免疫分析技术介绍磁微粒化学发光免疫分析技术综合了磁微粒载体技术和化学发光免疫检测技术，使测量结果更准确，更稳定。
●磁微粒化学发光--双抗体夹心法：待测抗原同荧光素标记的抗体及酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。
化学发光免疫分析(CLIA)原理
化学发光免疫分析（CLIA）原理化学发光免疫分析（CLIA）就是将免疫反应和化学发光反应相结合,藉以检测抗原或抗体的技术。
它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发射光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。
CLIA的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽,可实现全自动化等。
这里的化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。
某些反应的产物生成后会吸收反应释放的能量，从而跃迁至激发态，然后又回到基态，过程中产生光辐射，就是发光。
免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。
免疫学的发展主要经过了三个阶段：放射免疫法（RIA）已经处于衰退期，仍普遍用于县级以上医院，试剂系列化；酶联免疫发（ELISA）普遍用于临床机构，产品成熟，试剂尚未系列化（运用色原ADPS，TOOS，MAOS等同过氧化氢偶联的方法就是属于此类）；化学发光免疫法（CLIA）这个是比较先进的方法，个别较大医院应用，在国外已经比较成熟，但国内尚属于导入期或成长期，主要依赖进口。
化学发光的底物主要有如下几类：一、酶促反应的发光底物：鲁米诺，AMPPD等（德晟科技生产的还有异鲁米诺及鲁米诺钠盐）以鲁米诺发光原理为例：鲁米诺的发光原理：鲁米诺在碱性条件下，过氧化氢（氧化剂）以及酶的存在下，生成一种具有发光性能的电子激发态的中间体3-氨基邻苯二甲酸。
由激发态转化为基态的过程中，以光子的形式释放出的能量，波长位于可见光的蓝色部分。
用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原（或抗体），在与反应体系中的待测物标本与固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体的复合物（洗涤清除未发生免疫结合成复合物上的抗原及标记抗体），这时加入鲁米诺发光剂，过氧化氢和发光增强剂是产生化学发光。
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板式化学发光
适合流行病调查、疾病预防与控制、 体检中心，以及医院血站等大样本检 测项目的使用（比如HIV、TP、HCV和
乙肝两对半等）。
通常采用96孔白色不透明微孔板进行包 被，不方便随到随测和医院急诊；
对于定量检测需要做标准曲线。
国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光
采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；
1977年诺贝尔生理学或医学奖得主雅洛 Yalow
雅洛1921年出生于纽约， 1945年获得核物理学博士学位， 1975年当选美国科学院院士。因 为发明了放射性免疫分析法，雅 洛获得1976年的拉斯克基础医学 奖，成为历史上第一位获得该奖 的女性科学家。次年，她因为与 同事合作开发了“针对多肽类激 素的放射性免疫分析法”而成为 诺贝尔生理学或医学奖史上第二 位女性获奖者。
免疫学检测
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、 抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子 生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：
抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测 细胞因子的检测 免疫相关基因分析 免疫标记技术 免疫PCR(IM-PCR)技术 杂交瘤技术与T细胞克隆技术
化学发光按化学反应类型分为：
直接化学发光（非酶促化学发光）
吖啶酯系统 异鲁米诺系统
间接化学发光（酶促化学发光）
辣根过氧化物酶—鲁米诺系统（HRP系统） 碱性磷酸酶—金刚烷系统（AP系统） 电化学发光
其它
直接化学发光
直接化学发光：以化学物 质,如异鲁米诺、吖啶酯 等直接标记抗原或抗体， 免疫反应后，直接引发化 学发光反应进行检测。
R
R
CH3 N 光子 + CO2 +
R
CH3 N + C=O O
OH
O
O
R
碱性磷酸酶化学发光系统
金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统 O O OCH 3 O O OCH 3
AP
OPO32-
OOCH3 * 光子(477nm) O-
碱性磷酸酶及其衍生物的化 学发光系统
O +
O
化学发光的检测类型
两大反应体系：
辣根过氧化物酶（HRP）系统：氧化还原反应，稳定性差
源德、科美、安图
碱性磷酸酶（AP）系统：水解反应，灵敏度较高
贝克曼：Access 1、Access 2，DXI600、DXI800 西门子：Immulite1000 , Immulite 2000 达成生物：AULIN200
发光免疫分析基本操作步骤(一步法)
待测样品 标记抗体或抗原
包被抗体或抗原的磁珠或反应管 反应15-60分钟 洗涤去除未结合的反应物
反应0-5分钟 发光底物 （或发光剂）
仪器检测
鲁米诺化学发光系统
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统 O
H2O2+
NH
NH NH2 O
HRP
CO2+Photon (425nm) N2 CO2-
OH-
NH2 增强剂（Enhancer）
OH R B OH R OH R
N OH S
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物
吖啶酯化学发光系统
CH3 N+ 吖 啶 酯 化 学 发 光 系 统 OHH+ CH3 N H2O2 CH3 N + H2O HOO C=O O
C=O O
HO C=O O
提高发光强度，快速达到稳定发光。
管式化学发光大多用磁微粒，板式化学发光使用微孔板载体。
Y
化学发光免疫分析技术的优越性
灵敏度高：CLIA灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光 底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏50万倍。
产品：
吖啶酯标记 : 西门子Siemens Centaur XP CP 雅培Abbott Architect i2000 异鲁米诺标记 ：索林DiaSoin Liaison 新产业
间接化学发光
以碱性磷酸酶系统为例
间接化学发光：用参与发 光反应的酶来标记抗原或 抗体，免疫反应后，加入 发光底物，测定发光体系 的发光强度来进行抗原或 抗体的检测。
抗原抗体免疫反应特点
高特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗 原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应的高特异性是 免疫学检测的基础。
高亲和性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其 反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决 定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
免疫分析标记技术的发展
60年代
放免
酶免
70年代
发光
90年代
化学发光
化学发光：由于化学反应（通常是氧化）底物从基态跃迁为激 发态，激发态返回基态时，跃迁能量以光子形式释放的现象。
物质激发态
吸收光谱
吸 能
过程基本原理
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测 微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。 美国临床化学会议规定：凡是通过测量光子计数的方法都是化学发光， 包括通过酶促luminol发光。 化学发光免疫分析1980’s进入体外诊断领域，第一台全自动检测仪1993 年诞生。
0
酶标 荧光 放免 发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
化学发光免疫分析技术的优越性
安全性好：彻底消除了放射性危害，环保、安全。到目前为止，还未发现CLIA的 危害性。 光信号持续时间长：辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小 时甚至一天。简化了实验操作及测量。容易实现连续、动态、重复测定。 分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂） 的一步法，容易实现自动化。 结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种 可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析 结果灵敏稳定可靠。
可以随到随测，适用于医院急诊； 定量检测的标准曲线存储在试剂条形码中， 可在2-4周内直接使用。
国外厂家全部是管式化学发光系统
磁微粒分离技术
磁微粒示意图
磁微粒分离技术特点： 较微孔板扩大抗原抗体结合表面积，增加抗原或抗体的结合量， 提高检测灵敏度。 加快反应速度，迅速捕获抗原抗体。
易于结合相、游离相的分离，提高检测准确性。
免疫分析
免疫反应： 抗原进入机体，刺激机体的免疫系统，使之产生免疫应 答，这种反应叫免疫反应。免疫反应应答包括对抗原物质的 感应、反应、效应三个连续的阶段。
免疫分析（immunoassay，IA）： 在临床检验中，基于抗原与其配对抗体能够发生特异反 应，用已知的抗原或抗体检测分析体液中的抗体或抗原性物 质。
线性范围
105
104 103 102
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术线性范围的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
试剂有效期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的 衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光 相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。
有效期（月） 18 15 12 9 6 3
直接标记：吖叮酯标记 间接标记：碱性磷酸酶-金刚烷系统
电化学发光：三联砒啶钌
国际主流免疫诊断公司均采用第二代化学发光标记物： 吖啶酯（雅培、西门子）、碱性磷酸酶-金刚烷（贝克曼、西门子）、三 联砒啶钌（罗氏）。
化学发光的检测方式
化学发光按检测方式分为：
随机处理模式：管式化学发光（磁微粒分离） 批处理模式： 板式化学发光（物理吸附）
电化学发光
电化学发光：一种在电极 表面由电化学引发的特异 性化学发光反应，直接由 三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 标记抗体，反应时标记物 直接发光。
产品：
Roche：Elecsys2010、COBAS e411、COBAS e601
化学发光的发展史
第一代：鲁米诺及其衍生物 第二代：
化学发光免疫分析技术的应用
甲状腺激素 生殖激素 肾上腺/垂体激素 贫血因子 肿瘤标志
糖尿病 心血管系统 病毒标志 骨代谢 过敏性疾病
感染性疾病
治疗药物监测
结论
化学发光免疫技术是理想的体外诊断技术：
高灵敏性、特异性和稳定性 宽线性范围
使用范围广
高通量和高度自动化 无放射性危险
灵敏度(mol/L)
10-18 10-15 10-12 10-9
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术灵敏度的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
线性范围宽：发光强度在4～6个数量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系。 这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于 放射免疫分析技术。