临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用

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化学发光免疫分析发展史 CLIA
➢ 简史:本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析 ,利用发光的化学反应分析超微量物质,特别是用于临床免疫分析中检 验超微量活性物质。目前,这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床 医学的常规检测手段。
➢ 原理:发光底物在酶的作用下,底物发生化学反应并释放出大量的能量 ,产生激发态的中间体。这种激发态中间体,当其回到稳定的基态时, 可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额,该光 量子产额与催化的酶的量成正比,由此可以建立标准曲线并计算样品中待 测物质的含量.

试剂逐步系列化

3.厂商试剂与仪器共同开发,仪器自

动化程度高,试剂系列化状态好。

放射免疫技术(RIA)

• 技术成熟度高 • 放射性(125 I)污染和危害 • 125 I 的半衰期短,试剂有效
期短 • 标记物Байду номын сангаас25 I 的稳定性差,批
间、批内的变异较大 • 标准曲线有效期短,必须每

Rosalyn Yalow, 1977

电化学发光免疫分析 学手段相结合

三联吡啶钌三

(ELCIA)

丙氨系统

荧光免疫分析

根据抗原抗体反应的原理, 先将已知的抗原或抗体标 记上荧光素,制成荧光抗 体,再用这种荧光抗体 (或抗原)作为探针检测 组织或细胞内的相应抗原
(或抗体)

荧光素

发光类型 闪光型 辉光型 闪光型 闪光型

【化学发光免疫分析种类】

标记免疫学分析技术发展历程
• 免疫荧光分析(Coons, 1941) • 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) • 酶联免疫吸附分析 (Engvall, 1971) • 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) • 化学发光免疫分析(Arakawa, 1977) • 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila,1979) • 电化学发光免疫分析(Leland, 1990)

原理图

【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光 原理:发光过程和原理与吖啶酯完全相同,但激 发发光速度更快,在3秒内完成整个过程,测试 速度最快,而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、 易水解的缺点。
代表仪器:德国Byk–Sangtec公司的LIAISON

原理图

【化学发光免疫分析种类】
2、酶促化学发光或持久发光 原理:酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶(AP)

中国
1.兴起于20世纪70年代,现仍普遍 使用于县级以上医院; 2.产品处于衰退期; 3.厂商试剂与仪器共同开发,试剂 基本系列化。
1.兴起于20世纪80年代,现普遍使 用于各级临床机构,为我国临床免 疫诊断的基本方法;2.产品处于成 熟期; 3.厂商试剂和仪器共同开发,试剂 尚未系列化。

欧美
1.兴起于20世纪60年代,现已基本退 出临床应用; 2.产品生命周期已终结; 3.厂商试剂和仪器共同开发,试剂基 本系列化

2 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯 中,再次孵育9分钟,使生物素通过与 亲和素的结合将磁珠、
抗-HBs连接为一体,形成双抗体夹心 法

3 蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+-抗体-抗原-抗体-磁 珠复合体吸入流动测量室,此时,磁珠被工作电极下 面的磁铁吸附于电极表面。同时,游离的抗-HBs(与 生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体)也被吸出
• 最先进的免疫学分析技术之一 • 非开放性试剂系统; • 试剂价格过高

免疫学检验技术发展趋势

集成高通量 精确灵敏 快速简便

❖ 阵列芯片 ❖ 液相悬浮芯片
❖ 化学发光 ❖ 时间分辨荧光 ❖ AlphaScreen
❖ 金标免疫层析检测 ❖ 磁珠免疫层析检测

化学发光免疫分析技术及其 在临床诊断中的应用
临床免疫分析发展趋势 及化学发光技术应用

- 免疫扩散 - 免疫沉淀/免疫凝集 - ELISA - IFA - RIA - ICT

- 化学发光 - 荧光偏振 - 微粒子酶放大化学发光 - 电化学发光 - 时间分辨免疫荧光 - 抗体芯片 - 透射和散射比浊 - 流式细胞技术

免疫学和自动化技术在临床免疫学诊断领域中的应用将大大加速

酶免疫分析技术 (EIA)
❖成本低廉 ❖定性、半定量和定量均可以检测 ❖O.D值在低中浓度范围与酶活性呈线性关
系 ❖可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果

化学发光免疫分析(CLIA)
• 灵敏度高,检测低限达10-19mol • 测定范围宽,可达9个数量级 • 自动化程度高,操作简单 • 试剂稳定性好,无污染有效期6-24月

TRFIA



BAYER ACS 180 Elecsys 2010 System

AxSYM

Access® 2 Immunoassay System

Elecsys 2010 System
电化学发光免疫测定(Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI)是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合 的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光(CL)不同,是 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上包括 了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动 发光反应,而CL是通过化合物混合启动发光反应。
• 代表仪器:瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010 和ELECSYS 2010。

罗氏 (Roche Diagnostics)
• 电化学发光检测技术(ELECSYS 1010 ELECSYS 2010)
• 原理图

操作步骤
1 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即 [Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀酰胺酯(NHS )的抗-HBs和结合了生物素的抗-HBs与 待测血清同时加入一个反应杯中孵育9 分钟
或辣根过氧化物酶(HRP)标记在抗体或抗原上, 固相抗体或抗原与AP或HRP标记的抗原、抗体复 合物在发光底物AMPPD或Luminol作用下,持 续发出可见光,通过光电倍增管读取光信号。 特点: 碱磷酶体系:水解反应,起光较慢,发光强度较 弱,灵敏度 较高。 辣根酶体系:氧化还原反应,起光较快,发光强 度较大。 代表仪器和试剂: 进口品牌:强生 VitrosECi(鲁米喏),美国贝克 曼公司的ACCESS (AMPPD) 。 国产主要厂家:郑州安图(HRP-LUMINOL) 、北京 源德(HRP-LUMINOL) 、泰格可信(HRP-
1.兴起于20世纪70年代,现仍在临床 应用; 2.产品处于衰退期; 3.厂商试剂和仪器共同开发,试剂基 本系列化。

化学发光免疫 法(CLIA)

1.导入于20世纪90年代,逐步进入 1.兴起于20世纪80年代,现已被临床

各大中医院;

普遍使用,成为临床免疫诊断的支柱

2.产品处于快速成长期;

方法;

3.正逐步实现试剂和仪器共同开发, 2.产品处于成熟期;

4.2光激化学发光(Lica) 博阳

4.3多种技术综合

美国雅培 AxSYM MEIA 日本东曹MEIA

时间分辨荧光免疫分析 TRFIA
基本原理 TRFIA是用镧系稀土元素螯合物标记抗
体或抗原,检测标本中相应的抗原或抗体, 用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产 物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对 荧光强度的比值,判断反应体系中分析物的 浓度,从而达到定量分析。
1.直接化学发光 A 吖啶酯发光 原理:纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物 ,在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下,快速发 出可见光,通过光电倍增管进行光子计数,相对光强度 RLU与待测抗原浓度成函数关系。 特点:发光过程在5秒内完成,激发发光程序简单,测 试速度快,但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定,易 水解,影响试剂稳定性。 代表仪器:拜耳公司的ACS180,雅培Architect。

英国强生 VitrosECi(鲁米喏)
• VitrosECi(鲁米喏) • 原理图

【化学发光免疫分析种类】
3、电化学发光 • 原理:纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体
复合物,在三丙胺的作用下,发生氧化还原反应,发 出可见光,通过光电倍增管进行光子计数,相对光强 度RLU与待测抗原浓度成函数关系。 • 特点:激发发光过程复杂,时间长,每一个发光过程 约需25秒,测试速度慢。
测量室

4 蠕动泵加入含三丙胺(TPA)的缓冲液 ,同时电极加电压,启动ECL反应过程

5 终止电压,移开磁珠,加入清洗液冲 洗流动测量室,准备下一个样品测定

【化学发光免疫分析种类】

4、免疫荧光

4.1时间分辨免疫荧光(TRFIA) 美国 PerkinElmer 芬兰 Wallac 新波 达安基因
➢ CLIA试剂盒国产化程度已经较高,质量与国外产品的差距逐渐减小。 ➢ 缺乏国产化的自动检测仪器

发光检测方法分类和对比

类型

原理

试剂

化学发光免疫分析 (CLIA)

化学发光物质直接标 吖啶酯

记抗原(体)

异鲁米诺

鲁咪诺系统

化学发光酶免疫分析 在酶免疫分析完成后 AMPPD系统

(CLEIA)

加入底物

电致化学发光与电化

近代临床免疫诊断技术发展历程
临床免疫诊断技术的发展基本历经了以下三个阶段:

20世纪

化学发光免疫诊断技术(CLIA)

酶联免疫诊断技术(ELISA)

60年代

放射免疫诊断技术(RIA)

70年代

80年代 90年代 2000年

2020年 时间

近代临床免疫诊断技术发展历程

方法
放射免疫法 (RIA)
酶联免疫法 (ELISA)
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