化学发光免疫分析技术原理简介

化学发光免疫分析技术原理简介

20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。

一、化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或

抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试

剂货架寿命长，稳定性好，具有大规模自动化测试的功能。这项技术发展很快，已有许多厂商生产各具特色的测定仪器与配套试剂。目前我国仪器与试剂均需进口，测定成本较高。其反应过程分为以下两个阶段。 (1)待测抗原(Ag) 和一定量的碱性磷酸酶标记抗原( ALP-Ag) 同时与一定量的特异性抗体(Ab) 竞争结合。ALP-Ag-Ab 的量与Ag 的量之间存有竞争抑制的关系，即Ag 的量越多，形成的Ag-Ab 的

量就越多， ALP-Ag-Ab 的量越少。反之亦然。

(2) 加入(羊)抗鼠IgG 包被的磁性颗粒，捕获ALP-Ag-Ab( 其中的Ab 为鼠单

克隆抗体) ，在磁场作用下将ALP-Ag-Ab 与ALP-Ag 分开，经洗涤并吸弃废液后，加入化学发光底物

( dioxetane-phosphate ,AMPPD) ，后者为带有二氧四联环稳定结构的化合物，在ALP 的作用下去掉磷酸根，生成不稳定的中间体。中间体迅速分解并同时

释放出光子。光子的生成量与ALP-Ag-Ab 的量成正比，由此可计算出待测抗原

( Ag) 的量。将一系列已知浓度的标准液与待测标本同样处理，即可绘出标准曲线并据此查出标本中待测抗原的浓度。

二、电化学发光免疫分析

电化学发光免疫分析( electrochemi1uminescence

immunoassay ,ECLlA )克服了CLlA 技术中每一发光分子只能利用一次的缺

点，其基本原理是利用三联吡啶钌[ Ru ( bpy) 3 ] 2+ .和三丙胺(TPA) 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，分析过程可通过电场精确控制，因此具有特异性好、灵敏度高、线性测定范围宽、操作的自动化程度高等优点。但目前这项技术所需的仪器以及配套试剂均需进口，测定成本较高。ECLlA 的体系中主要有两个部分，即免疫反应系统和电化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同，因此具有较高的特异性;电化学发光系统包括电化学和化学发光两个过程。在电极表面的电场作用下，二价的三联吡啶钌[ Ru ( bpy ) 3 ] 2

+失去一个电子，成为三价的三联吡啶钌[ Ru ( bpy) 3 ] 3+，三丙胺(TPA)也失去一个电子被氧化随即脱氢成三丙胺自由基自由基传递一个电子给三价的三联吡啶钌使还原成激发态的二价三联吡啶钌[Ru ( bpy ) 3] 2+ ，后者很不稳定，以发射一个波长为620 nm 的光子的形式释放能量而回到基态。这个过程可反复进行，直到电场中的三丙胺耗尽。因此测定过程中的一个抗原抗体复合物可产生许多光子信号，从而产生生物放大效应，极大地提高了方法的灵敏度。此外测定方法还应用了链霉亲合素，生物素技术、磁性分离技术等，使其准确性、灵敏度以及自动化程度都很高。实测技术有双抗体夹心法与竞争法，下面以双抗体夹心法为例，简述反应过程如下。

(1)待测抗原( Ag) 、一定量的生物素化抗第一位点单克隆抗体( Ab )和三联吡啶钌[ Ru( bpy) 3 ]2+. 标记的抗第二位点单克隆抗体于反应

体系中相互结合，形成相对分子质量大的抗原抗体"夹心"复合物。 Ag + Ab + [ Ru ( bpy)]2 + Ab [ Ru ( bpy) 3 ] 2 + Ab - Ag - Ab

由于上述的两种单克隆抗体在试剂中都是定量的，因此待测抗原的量与抗原抗体复合物的量成正的线性关系。

(2) 加入链霉亲合素包被的磁性微粒，通过生物素与链霉亲合素的反应使上述大分子复合物与磁性微粒紧密结合。

(3) 将上述反应体系通过蠕动泵吸入测量室中，磁性微粒被工作电极下的磁铁吸附于电极表面，未结合的游离物均被洗弃。再通过蠕动泵加入含TPA 的缓冲液，同时给电极通电产生化学发光，并启动光电倍增管检测光子强度。光子强度与三联吡啶钌的浓度亦即抗原抗体复合物的量呈线性相关。检测结果由仪器自动从标准曲线上查出，此曲线由试剂条形码扫描入仪器并通过两点定标校正。