MDCK无血清培养基说明书(2015.9.16)
NK细胞无血清培养套装使用说明书——脐血2L体系
NK 细胞无血清培养套装使用说明书——脐血2L 体系【适用范围】【试剂准备】【使用步骤】【产品组成】【脐血PBMC 分离】用于脐带血体外诱导扩增NK 细胞。
如用采血袋采集，由于采血袋中含有抗凝剂，务必保证血样净含量50mL （不包括抗凝剂体积），否则在接种细胞时细胞的总数量达不到接种要求，最终收获不到理想细胞数。
2L 培养体系套装：适用于50mL 脐带血的样本量，使用2L 培养基。
分离单个核细胞前，应将脐血、PBS （生理盐水）和淋巴细胞分离液室温平衡至20℃。
将脐带血平均分装到50 mL 离心管中，于室温下700g 离心15 min （离心机升速8，降速4）， 取上层淡黄色血浆至新的50mL 离心管中（下层红色液体用于提取单个核细胞），于水浴锅中 56℃灭活30min ，然后900g 离心10min ，取上清，置于-20℃，15min ，再次900g 离心10min ， 取上清，置于4℃保存。
（900g 离心时离心机的升降速均调节至最高即可） 1. 第0天T175培养瓶包被:先将15mL PBS 加入T175瓶中，再将一支YC00A 添加于T175瓶中，充分混 匀后，37℃孵育2h ，弃去上清，并用15mL PBS 清洗一次,弃清洗液后备用。
接种45mL 培养 基A ，细胞密度2-3E6/mL ，添加诱导因子一支YC00B ， 添加10%比例的自体血浆。
2. 第3天补加100mL 培养基B ，添加5%的自体血浆，动作轻柔、不可将贴壁细胞晃起。
3. 第5天补加150mL 培养基B ，添加1%的自体血浆，分成两个T175进行培养，分瓶时轻轻将底部细胞 团吹起，单个的贴壁细胞不用过度吹打。
4. 第7天补加300mL 培养基B ，添加1%的自体血浆，轻轻地将细胞团晃起后把所有细胞转移至细胞培 养袋，原瓶中各添加50mL 新鲜培养基B 。
原瓶中的单个贴壁细胞不用过度吹打。
(1) 取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水1：2稀释，混匀，备用。
适合MDCK细胞培养的基础培养基的筛选
适合MDCK细胞培养的基础培养基的筛选摘要：目的：MDCK细胞为犬肾成纤维细胞，呈不规则圆型梭状。
本实验是为了选择优质的细胞培养基础培养基，满足MDCK细胞贴壁增殖的需要，制备优良的MDCK细胞，为下一步制备流感病毒疫苗打下好的基础。
方法：本次实验研究主要是选择不同的细胞培养基础培养基，MEM、DMEM（高糖）、DMEM（低糖），采用来源于美国ATCC提供的MDCK细胞进行贴壁连续传代培养，连续同等条件下传3代，通过镜下观察及细胞计数比较MDCK细胞，应用不同培养基连续传代培养的效果。
结果：通过显微镜下观察及细胞计数，综合评价细胞生长效果，选择出适合于MDCK细胞贴壁培养的最佳基础培养基。
结论：通过对以上结果的分析，MEM基础培养基及DMEM（H）基础培养基均可用于MDCK细胞培养，但是MEM基础培养基可保持稳定的细胞对数生长期，DMEM（H）促进细胞前期生长较快。
关键词：MDCK细胞、MEM培养基、DMEM培养基英文摘要及关键词：MDCK细胞是S.H.MADIN于1958年9月建成，来源于考克斯班尼犬肾脏，该肾脏细胞原代培养时其形态类似于成纤维细胞，经过胰蛋白酶和EDTA混合消化液的连续多次消化法纯化而呈上皮样细胞，每次纯化间隔时间为7D。
MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒及禽流感病毒等。
由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。
传统的MDCK细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式。
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以有效地促进细胞生长和产物表达。
[１[[２[[３[材料：MDCK细胞：美国ATCC提供，ATCC编号CCL-34，批号70040764；viability 94%、VCD 2.4◊106/ml；MEM基础培养基：美国GIBCO公司，批号 2641712；基础培养基配方：9.5g/L，pH7.2～7.5、渗透压280～360mOsmol/Kg；细胞复苏培养液：MEM+20%胎牛血清；细胞培养液：MEM+8%胎牛血清；DMEM（H高糖）（L低糖）基础培养基：康宁生命科学（吴江）有限公司，批号04723001、04723002 ；基础培养基配方：13.7g/L，pH7.2～7.5、渗透压280～360mOsmol/Kg；细胞复苏培养液：DMEM+20%胎牛血清；细胞培养液：DMEM+8%胎牛血清；胎牛血清：太原润生生物公司，批号 202314100 ；胰蛋白酶：美国GIBCO公司，批号 2184134；0.25%胰酶配方：0.25g胰酶+100mlPBSEDTA：美国SIGMA公司，批号 102491206；0.02%EDTA配方：0.02gEDTA+100mlPBS二氧化碳培养箱：型号QP-160 山东博科科学仪器有限公司生物安全柜：型号HR30-IIA2 青岛海尔生物医疗股份有限公司细胞计数仪：型号Countstar Mira FL 上海睿钰生物科技有限公司倒置显微镜：型号DSZ2000X 重庆澳浦光电技术有限公司低速台式离心机：型号TDZ5-WS 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司细胞培养瓶（T25、T75、T175）：康宁生命科学（吴江）有限公司。
MDCK细胞培养细胞培养
MDCK细胞培养MEM细胞生长液配制500ml MEM液+5ml双抗（青霉素+链霉素）+5ml L-谷氨酰胺+7.5ml碳酸氢钠+50ml小牛血清90%MEM液1%双抗1% L-谷氨酰胺 1.5%碳酸氢钠10%小牛血清0.25%EDTA胰酶（从冰箱取出后放入培养箱中待用）（1）细胞传代将细胞瓶中的生长液倒去，加入MEM液（大概6ml左右）清洗，倒去;加入EDTA-胰酶（根据细胞消化情况而加量），倒去;再加入EDTA-胰酶，放置培养箱，进行消化（大概10分钟左右），待其细胞开始脱落后（在细胞瓶中呈毛玻璃）;吸干EDTA-胰酶倒去，放置培养箱一段时间（细胞呈逐个完整），取出；【细胞生长好，多,可1传3或者1传4】将配好的细胞生长液吸入，吹打混匀，待完全脱落至过长液中;将其分装入细胞瓶和细胞板中。
6ml/瓶37℃培养1ml/孔CO2培养箱（用于标本接种）（2）标本处理复融，从-70℃冰箱取出，常温下溶解；充分震荡，后取出试导，至4℃冰箱中，静置20分钟左右；取螺旋管，在其加入0.2ml的双抗（20%），后加入1.8ml的病毒液，放置4℃，过夜上毒。
（3）细胞上毒（需培养一周）洗细胞，将细胞板（前一天）上的液体（生长液）吸干，加入1ml的MEM，清洗，重复一次，然后吸干；加入处理后的病毒液180ul；放置CO2培养箱中1.5h。
将细胞板取；1ml/孔加入病毒过长液后，放置CO2培养箱，培养一周；并将上周上毒的细胞液取出，放置-70℃冰箱，隔天鉴定。
配制病毒过长液：100mlMEM中加入1ml双抗，1ml L-谷氨酰胺1ml TPCK-胰酶 1.5ml碳酸氢钠血凝试验：病毒经系列稀释，与一定浓度的红细胞混合，混合液放置在专为血凝试验设计的板的圆底中，未出现凝集的红细胞可在孔底自由滚动，形成浓密的，极易识别的细胞团，而凝集红细胞不能在池底自由滚动，均匀地覆盖池底。
（4）1%人O型红细胞洗涤首先应选择无乙肝病毒携带者的O型血，待其自然沉降后；吸取红细胞层的红细胞置入离心管中；加入无菌生理盐水至离心管2/3处，两管平衡后，1800r/10min；用无菌吸管吸去生理盐水，再加入生理盐水、混匀；重新离心，重复3次，离心取出后；取细胞瓶，吸取9ml生理盐水；加入1ml的离心好的红细胞，混匀即可。
人淋巴细胞无血清培养基（ELISPOT 专用）说明书
第1页共2页人淋巴细胞无血清培养基（ELISPOT 专用）说明书【产品名称】通用名称：人淋巴细胞无血清培养基（ELISPOT 专用）【规格】100mL/瓶；500mL/瓶【预期用途】仅用于在ELISPOT 检测技术中对细胞的培养，不具备对细胞的选择、诱导、分化功能。
培养后的细胞用于体外诊断。
【检验原理】ELISPOT 技术是根据ELISA 技术的基本原理，建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和细胞因子分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。
由于其灵敏度高、操作简便经济，因此备受青睐。
传统的ELISPOT 检测技术中，细胞培养这一步使用的多为含有FBS 或者FCS 的培养基，由于血清中含有的很多未知成分能够抑制或者刺激细胞，从而干扰实验，并且由于血清的不确定性，不同批次对于实验的影响也不同，造成了实验的重复性降低。
本产品可有效避免血清质量变动及血清组分对实验研究的影响，提高细胞培养和实验结果的重复性。
【主要组成成分】无机盐、氨基酸、维生素、糖类、蛋白等。
【储存条件及有效期】1、2℃~8℃密封避光保存，避免污染。
2、在储存条件下有效期为一年。
【样本要求】1、细胞要求：新鲜分离的人淋巴细胞。
2、细胞悬液要求吹打混匀，成单细胞悬液。
【检验方法】1、取ELISPOT 板，每孔加入200μL 本产品，室温静置5-10分钟后将其扣出。
2、取新鲜分离的人淋巴细胞，使用本产品调整细胞浓度。
3、将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100μL/well 。
4、正对照孔加入阳性刺激剂工作液；负对照孔（含背景负对照孔）加入本产品；实验孔：加入实验者自己的刺激物。
5、所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。
放入37℃，5％CO 2培养箱培养16-24小时。
6、显色：按照标准ELISPOT 操作流程进行细胞裂解、洗板、检抗孵育、酶孵育、显色，记录板底斑点数并分析。
【检验结果的解释】结果显示阳性孔斑点分布均匀、频率较高、斑点较大、圆润、线性好、背景干净；阴性对照孔无斑点或有极少斑点，背景干净，无杂色。
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MDCK细胞传代 1. 细胞长至融合度达到80％-90％时，弃去培养液，用PBS或不含钙镁的Hank’s液清洗 细胞2-3遍。 2. 加入适量0.25%的EDTA-胰酶，37℃，5%CO 2培养箱中孵育至细胞收缩变圆，轻拍培养 瓶可见细胞移动即可。 3. 加入无血清培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，使细胞分散。 4. 细胞悬液转入离心管中，800 rpm离心5分钟，去除上清液，重新加保存 有效期12个月
产品特性
1. MDCK细胞无血清培养基化学成分限定，不含胎牛血清。 2. MDCK细胞无血清培养基培养MDCK细胞，连续传代50代，细胞特性无改变。 3. MDCK细胞无血清培养基培养MDCK细胞的倍增时间是17.1小时。
使用说明
MDCK细胞复苏 1. 从液氮罐中取出冻存管直接置于37℃温水中，并不断地轻轻摇动，使管中的液体迅速 融化。 2. 用吸管吸取10 ml 预温的MDCK无血清培养基到15 ml离心管中，冻存管用75%酒精擦拭 表面后，将细胞悬液吸到15 ml离心管中，混匀。 3. 800 rpm离心5分钟，除去上清液，用适量预温的无血清培养基重悬细胞，接种于细胞 培养瓶中。 4. 37℃，5%CO2培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养1-2天至细胞铺满瓶底的 80%-90%进行传代。
2 5. 以（1-5)×10 cells/cm 接种于细胞培养瓶内，置37℃ 5%CO2 培养箱中培养，细胞长满 4 2
瓶底80%-100%后进行下一次传代（一般2-3天传代一次）。 MDCK细胞冻存 1. 选取融合度达80%的MDCK细胞用于冻存。 2. 依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，800 rpm离心5分钟。 3. 去除上清液，加入商品化的细胞冻存液或无血清配制的冻存液（冻存液需要提前预冷）， 冻存液中细胞的最终密度为（5-10）×10 cells/mL。用吸管轻轻吹打是细胞混匀，然后 分装至无菌冻存管中，每只冻存管加液1-1.5 mL。 4. 细胞经过程序降温后置于液氮中保存。 流感病毒的分离与培养 1. 选取融合度75％-90％的MDCK细胞，弃去培养液，PBS或不含钙镁的Hank’s液清洗 细胞2-3遍。 2. 加入200 uL的流感病毒标本，温和摇动数次。 3. 放于37℃、5% CO2培养箱中吸附1-2小时。 4. 加入6 mL流感病毒分离无血清培养基于培养瓶中。放置于35℃，5%CO2培养箱中培养。 5. 每日观察细胞病变情况。无血清培养基培养的MDCK细胞，病毒侵染后释放快，请及 时收获病毒。
MDCK细胞无血清培养基使用说明书
产品简介
MDCK细胞无血清培养基是一款专门用于培养MDCK细胞的无血清培养基。培养基 中不含胎牛血清成分，细胞培养过程中也不需要添加任何血清，无血清培养的MDCK细 胞可达到完全培养基（90%DMEM+10%FBS）培养的状态，连续传代后，无血清培养基 培养的细胞状态和生长速率比完全培养基培养的更好。 MDCK细胞无血清培养基不含胎牛血清，化学成分限定，在流感病毒分离中能排除 血清中类淀粉蛋白P等物质对病毒吸附的影响，同时，细胞可以直接转入无血清培养基中 培养，不需要经过血清浓度逐步降低的驯化过程，能极大的帮助疾控、高校和科研院所 1 的工作人员提高实验进度。
注意事项
MDCK细胞无血清培养基严禁置于-20℃保存，因培养基的包装规格是500 mL/瓶，实 验前请将培养基分装至T-25细胞培养瓶等进行37℃预温，且预温时间不宜超过3小时， 严禁培养基反复或长时间预温，否则可能会影响到培养基的性能。