无血清培养基试验总结

用无血清培养基制备V ero细胞

狂犬病疫苗的实验研究

1材料

细胞株：

V ero 细胞（中国典型培养物保藏中心CCTCC）

病毒株：

CTN-1V株（中国药品生物制品标准化研究中心）

培养基及添加物：

Medium 199（Gibco公司）

无血清培养基（Gibco公司、Hyclone公司）

新生牛血清（兰州民海生物有限公司）

细胞培养容器：

T75培养瓶，2L转瓶，10L瓶

仪器设备：

细胞培养恒温室，XDS倒置显微镜，转瓶机，7.5L生物反应器

2方法

2.1 2L转瓶试验方法

2.1.1具体步骤

用T75细胞瓶培养复苏的V ero细胞，按照常规方法传代扩增至一定数量的2L转瓶中，待细胞长至均匀单层后接种病毒，换为不同浓度（分别为100%、50%、25%）的两个厂家的无血清培养基作为维持

液，同时以传统培养基（M199+0.2%人血白蛋白）作为对照组，根据病变情况收获病毒液并超滤层析。

2.1.2结果及讨论

2.1.2.1细胞状态比较

均匀的单层细胞接种病毒后,在尚未出现病变时，SFM试验组的细胞，体积略大于人白对照组的细胞，细胞轮廓清晰、饱满，病变的出现亦稍晚于对照组；约3-4天时均有病变产生：细胞面呈网状，有脱落、游离细胞。至5-6天收毒时，SFM试验组的细胞维持较好，未脱落细胞多于对照组，细胞维持时间较对照组长。

人白对照组细胞：

Hyclone SFM 试验组细胞：Gibco SFM 试验组细胞：

2.1.2.2滴度比较

2.1.2.2.1 100%SFM(Gibco)作为维持液与2‰人白M199作为维持液所收获的病毒液相比，滴度结果基本一致；但100%SFM(Hyclone)作为维持液的病毒液滴度稍高于人白对照组。（见表一）

表一

2.1.2.2.2在以不同浓度SFM作为维持液的试验中，两者之间差别不明显。（见表二）

表二

2.1.2.3抗原含量比较

由表三的结果可见，试验组的抗原含量均比人白对照组稍高；而表四中的结果无明显的区别。传统维持液中，人血白蛋白的作用是保护细胞和已经产生的病毒不失去感染性，保持病毒液中抗原含量不降低；而由上述结果可见，不同浓度的SFM均可以很好的支持细胞产生病毒，SFM中的添加成分如结合蛋白和转运蛋白具有一定的保护病毒的能力。所以从感染性滴度和抗原含量的角度考虑，SFM可以替代传统的含人白维持液。

表三

表四

2.1.2.4效价比较

对照组和实验组的纯化原液取样检测效价，结果均达到较好水平。（见表五）

表五

2.1.2.5DNA含量的比较

将人白对照组与SFM试验组的病毒收获液、超滤浓缩液及纯化原液分别取样检测DNA含量，结果显示SFM试验组DNA含量均低于人

白对照组。

2.2 7.5L生物反应器的试验方法

2.2.1具体步骤

用T75细胞瓶培养复苏的V ero细胞，按照常规方法传代扩增至一定数量的10L转瓶中，待细胞长至均匀单层后，使用含有0.04%EDTA 的胰酶溶液消化细胞，制备成一定浓度的细胞悬液，取样计数，接种入7.5L生物反应器中（微载体浓度：8 g/L）,调整各项参数至适宜水平，灌流培养细胞4~5天，该阶段使用传统的199培养基（含10%新生牛血清）作为细胞生长液；当微载体上的细胞生长至比较致密状态时，使用无血清培养基沉降换液3次，接种病毒，以浓度为70%的无血清培养基作为维持液灌流培养，约3天后，根据细胞病变情况灌流收获病毒液；将收获的病毒液及时澄清、超滤和层析。

细胞照片如下：

细胞培养三天（M199）病毒培养三天（M199）

病毒培养三天(Hyclone SFM) 病毒培养三天(Gibco SFM)

2.2.2结果及讨论

2.2.2.1病毒收获液的滴度比较

由上表可以看出，细胞接种病毒后，使用无血清培养基为维持液，细胞的维持时间稍长于传统培养基，且病毒滴度也稍高于传统培养基。而两个厂家的无血清培养基之间差别不明显。

2.2.2.2纯化原液的抗原含量比较

2.2.2.3效价比较

纯化原液取样检测效价，结果没有明显差异，均达到较好水平。

2.2.2.4稳定性考察：

3使用无血清培养基的优势

3.1疫苗制备方面：

3.1.1使用无血清培养基作为维持液，可以避免引入其它污染源。3.1.2细胞接种病毒后的维持情况较好，持续收毒时间较长，可以提高产量。

3.1.3使用SFM可以减少病毒收获液单位体积内的细胞DNA含量。

3.2成本：

以收获100L病毒液为例，含有0.2%人血白蛋白的199培养基大约需要8000元，而100%的SFM约为5000元；如果将SFM以一定浓度与199培养基配比使用，将会节约更多，例如使用50%的SFM 大约需要3000元。

4结论

无血清培养基可直接用于现有工艺制备狂犬病疫苗。在已有的V ero细胞库的基础上，使用传统培养基培养细胞，仅从细胞接种病毒以后使用无血清培养基，无需重建适应无血清培养基的细胞库，可以更好利用现有资源，节约成本。