实时荧光定量PCR—— qMan探针法及设计原则

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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Taqman MGB 探针设计
• 探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报 告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
• Tm值应为65-67℃。 • 尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。 • 尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4
个或4个以上的G重复出现。 • 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检
测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。
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实时荧光定量PCR——TaqMan探针法 •
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TaqMan技术引物设计原则
• 序列选取应在基因的保守区段；
• 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对， 避免引物自身形成环状发卡结构；
• 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序 列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
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TaqMan探针设计原则
• 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；
• 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；
• 探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；
• Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）， 以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在 40%－70%；
• Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
• 引物之间的TM相差避免超过2℃；
• 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3 个以上连续相同的碱基；
• 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；
• Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；
• 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
• 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而 且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；
• 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会 降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
• 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实 一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。