生物化学检验中酶的测定
临床生物化学检验-第7章 临床酶学检验技术
酶活性的国际单位定义； 酶活性测定的连续监测法的概念、计算和分 类；酶活性测定的影响因素及最适条件的确定原则。
血清酶变化的病理机制；酶动力学参数的含义；电泳法和免疫抑制法 测定同工酶的原理。
酶蛋白质量测定的优点；定时法测定临床常用诊断酶的原理和评价； 同工酶的其他检测方法。
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第一阶段（1908 ~ 1950） ：利用化学和有机化学的反应原理测定酶促反应生成量或底物消耗量定 时法测定AMY (1908年， Wohlgemuth)、 LPS、ALP、ACP等几种酶。
2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号： 数字前冠以EC ，数字之间用黑点 隔开。第一个数字表示酶的类别 ，第二个表示亚类 ，第三个表示亚-亚类 ，第四个表示 酶的编号序数：如EC1.1.1.27 LD (乳酸脱氢酶)。
3. 同工酶：催化相同化学反应， 但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的
心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤 心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤
红细胞、前列腺、溶酶体 γ-GT1、 γ-GT2、 γ-GT3、γ-GT4
前列腺癌、血液病、骨肿瘤 肝癌、梗阻性黄疸
P-AMY(P1、P2、P3)、S-AMY(S1、 S2、 S3、S4) ALT、 mALT AST、 mAST
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连续监测法（continuous monitoring assay）： 在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量 ，选取线性期的速率来
计算酶活性 ，又称速率法。将酶与底物在特定条件 (缓冲液、温度等) 下孵育 ，每隔一定时间 (2s∼60s) 连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信 号的变化 ，从而计算出每分钟的信号变化速率 ，求 出酶活性浓度。 尤其适合在自动化分析仪上使用
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
酶特性检验实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的通过本实验，了解酶的催化作用特性，包括酶的专一性、高效性、温度和pH值对酶活力的影响，以及酶的激活剂和抑制剂对酶活力的作用。
通过对酶特性的研究，进一步掌握酶在生物体内的作用及其调控机制。
二、实验材料1. 实验材料：- 酶提取液（如唾液淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等）- 底物溶液（如淀粉溶液、蛋白质溶液、脂肪溶液等）- pH缓冲液（不同pH值的缓冲液）- 温度控制装置（恒温水浴）- pH计- 显微镜- 试管、试管架、滴管、移液器等2. 试剂：- 碘液- 斐林试剂- 班氏试剂- 激活剂（如金属离子）- 抑制剂（如竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂）三、实验方法1. 酶的专一性检验：- 将酶提取液与底物溶液混合，观察酶催化底物反应的现象。
- 使用不同底物进行对比实验，验证酶的专一性。
2. 酶的高效性检验：- 将酶提取液与底物溶液混合，观察酶催化底物反应的现象。
- 使用相同底物，将酶提取液与无机催化剂（如FeCl3）进行对比实验，验证酶的高效性。
3. 温度对酶活力的影响：- 将酶提取液与底物溶液混合，在不同温度下进行反应。
- 观察酶催化底物反应的现象，分析温度对酶活力的影响。
4. pH值对酶活力的影响：- 将酶提取液与底物溶液混合，在不同pH值下进行反应。
- 观察酶催化底物反应的现象，分析pH值对酶活力的影响。
5. 激活剂和抑制剂对酶活力的影响：- 在酶提取液和底物溶液中分别加入激活剂和抑制剂。
- 观察酶催化底物反应的现象，分析激活剂和抑制剂对酶活力的影响。
四、实验结果与分析1. 酶的专一性检验：- 通过实验观察，酶提取液在特定底物存在下表现出催化作用，而在其他底物上无催化作用，证明酶具有专一性。
2. 酶的高效性检验：- 通过实验观察，酶提取液在催化底物反应时，反应速度明显快于无机催化剂，证明酶具有高效性。
3. 温度对酶活力的影响：- 通过实验观察，酶催化底物反应的速度随温度升高而加快，在一定温度范围内，酶活力达到最大值，超过此温度，酶活力逐渐降低。
生物化学实验指导：酶的活性测定实验
生物化学实验指导：酶的活性测定实验1. 引言在生物化学领域，测定酶的活性是一项重要的实验技术。
酶是生物体内参与许多生化反应的催化剂，能够加速反应速率。
通过测定酶的活性，我们可以了解其催化效率和特性。
本实验旨在教授如何测定某一种酶的活性，并提供相应步骤和分析方法。
我们选择一种常见的酶作为例子，详细介绍实验操作步骤和数据处理方法。
2. 实验材料•酶提取物•底物（适合所选酶催化反应的底物）•缓冲溶液（pH值适合所选酶催化反应的缓冲溶液）•辅助试剂（如辣根过氧化物酸）•试剂盒或相关仪器设备3. 实验步骤步骤1：制备必要溶液1.准备合适浓度并调整pH值适合实验目标的缓冲溶液。
2.准备底物溶液，确保其浓度符合实验要求。
步骤2：制备标准曲线1.准备一系列不同底物浓度的标准溶液。
2.按照指定的方法将不同底物浓度的标准溶液与酶提取物混合。
3.在一定时间间隔内，记录反应进程中释放的产物（如颜色变化）。
步骤3：样品预处理1.从所需生物样品中提取目标酶。
可以采用相关提取方法，如超声波法、机械破碎法等。
2.将提取得到的酶溶液进行适当稀释，以便后续操作过程中能够在合适浓度范围内工作。
步骤4：活性测定实验1.将提取得到的目标酶与底物溶液以及其他必要试剂加入适当容器中，形成反应体系。
2.控制温度和pH值，确保反应条件符合要求。
3.运行反应体系一段时间，并记录反应进程。
步骤5：数据处理和分析1.使用已经制备好的标准曲线，根据测试产生的光吸光度（或其他测量结果）计算出底物的浓度。
2.根据所得底物浓度和反应时间，计算出酶催化反应速率。
3.通过对不同条件组的实验数据进行比较和统计分析，可以进一步了解酶活性受到哪些因素影响。
4. 结论通过本实验指导，我们能够学会如何进行酶的活性测定实验，并熟悉基本的数据处理和分析方法。
这一实验可以为进一步探究酶催化机制、优化酶工艺等提供基础。
实践中，可以根据具体需求对该实验设计进行适当调整和补充。
生物化学中的酶的研究
生物化学中的酶的研究酶是一类生物大分子催化剂，是生物化学中最基本和最重要的研究对象。
酶可以加速和控制生物反应速率，在许多生理过程中都发挥着极为重要的作用。
一、酶的分类按照作用类型，酶可以分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、合成酶等。
按照分子结构，酶可分为，结构酶、非结构酶、多组分酶等。
按照催化机理，酶可以分为物理吸附型、化学反应型和催化后处理型。
二、酶的活性酶的活性受多种影响，包括温度、ph值、离子强度、金属离子和电解质含量等。
高温和极端的酸碱度会使酶丧失功能，但适宜的温度和ph值有助于提高酶的活性。
三、酶的初始速度酶的反应速度随着底物浓度的增加而增加，但当底物浓度达到一定值时，速率几乎不再增加，即达到最大反应速度。
此时酶的反应速率称为饱和速率，酶的活性也达到最大值。
四、酶的动力学酶的动力学研究是了解酶在各种条件下的反应机制和活性规律的基础。
其中，最常用的方法是米氏方程，它能够表述酶速度与底物浓度之间的关系。
五、酶的应用酶具有广泛的应用价值。
例如，酶在制药和化妆品生产中被广泛使用，可以用于制备生物达成体和药物，长期稳定性好；酶也可用于催化生物转化反应，如酶在食品添加剂中的应用、酶在生产糖、啤酒上的应用等。
六、酶在疾病诊断中的作用酶可以作为生物标志物，广泛应用于疾病的诊断，其中，最典型的是肝病酶的检测，许多生化指标可用于诊断和监测肝脏疾病。
这些指标通常作为肝功能的一部分测试，并可以用于监测化疗剂对身体产生的不良影响。
总之，酶作为生命体系中极其重要的促进剂和调整剂，在生物化学领域中受到了广泛的研究和应用。
通过进一步深入地研究酶的原理和性质，我们将更好地了解生命系统的本质和机制。
生物化学检验中酶测定PPT课件
心脑血管疾病酶测定
要点一
总结词
心脑血管疾病酶测定有助于评估心脑血管系统的健康状况 。
要点二
详细描述
心脑血管疾病酶测定包括肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶 （CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）等指标的检测，这些酶在 心肌和骨骼肌中有特定的生理功能，当心脑血管系统受损时， 酶的活性会发生变化，通过测定这些酶的活性，可以判断心 脑血管系统的健康状况，对于心脑血管疾病的诊断和治疗具 有重要的意义。
04
酶测定在临床诊断中的应用
肝病酶测定
总结词
肝病酶测定是生物化学检验中的重要部分，用于评估肝功能状况。
详细描述
肝病酶测定包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）等指标的检测，这些酶 在肝脏中有特定的生理功能，当肝脏受损时，酶的活性会发生变化，通过测定这些酶的活性，可以判断肝 脏的功能状况，对于肝病的诊断和治疗具有重要的意义。
酶测定的重要性
酶是生物体内重要的生物催化剂，参与生物体的代谢和调控过程 。通过酶测定可以了解酶的活性、含量以及性质，进而了解生物 体的代谢状态和生理功能，为疾病诊断、治疗和药物研发提供科 学依据。
酶测定在生物化学检验中的应用
01 02
临床诊断
酶测定在临床诊断中广泛应用，如肝功、肾功、心肌酶谱等检测项目， 通过对特定酶的活性检测，可以判断相应器官的功能状态，辅助医生进 行疾病诊断。
详细描述
比色法是一种通过测量酶催化 反应后生成物的颜色变化来计 算酶活性的方法。该方法操作 简便，设备简单，适合大批量 样本检测，因此在生物化学检 验中广泛应用。
总结词
对试剂要求高、误差较大
详细描述
比色法对试剂的质量和浓度要 求较高，否则会影响检测结果 的准确性和可靠性。同时，由 于不同颜色的生成与酶活性之 间可能存在非线性关系，因此 该方法可能存在较大的误差。
生物化学中的酶动力学研究方法
生物化学中的酶动力学研究方法酶是一类生物大分子催化剂，在维持生物体内代谢活动中起着至关重要的作用。
酶动力学研究方法是生物化学领域中的一个重要研究方向，通过这些方法可以更好地了解酶在生物体内的功能和调控机制。
本文将介绍一些常用的生物化学中的酶动力学研究方法。
一、酶动力学参数的测定方法1. 酶动力学参数主要包括最大反应速率（Vmax）、米氏常数（Km）等。
常用的测定方法包括初始速率法、双底物法、双底物片段法等。
初始速率法通过实验测定不同底物浓度下的反应速率，然后利用米氏方程等进行数据拟合，从而得到Vmax和Km值。
双底物法和双底物片段法则是通过同时测定两种底物的反应速率，得到更为准确的酶动力学参数。
2. 此外，还有一些现代的高通量技术，如表面等离子共振（SPR）、等电聚焦（IEF）等，可以用来测定酶底物和产物的结合，进一步揭示酶的催化机理。
二、酶动力学活性的动态测定方法1. 体外实验是研究酶活性的重要手段之一，通过在离体条件下模拟生物体内环境，探究酶在不同条件下的反应动力学特性。
这种方法可以控制实验条件，准确地测定酶活性，并进一步研究酶的底物特异性和催化效率。
2. 另一种常用的动态测定方法是活体成像技术，如荧光标记技术、生物传感器等。
这些技术可以实时监测酶的活性变化，研究酶在不同生理环境下的活化和抑制机制，为深入理解酶的功能提供重要依据。
三、酶抑制剂的筛选方法1. 酶抑制剂是一类具有重要生物学意义的化合物，可以用来探索酶的功能和生理调控。
常用的酶抑制剂筛选方法包括荧光光谱法、生物晶体学、分子对接技术等。
这些方法可以快速筛选出具有潜在生物活性的酶抑制剂，并进一步研究其在生物体内的作用机制。
2. 酶抑制剂的筛选是药物研发过程中的重要环节，能够为新药的发现和设计提供重要线索。
通过这些方法，研究人员可以寻找到具有高效抑制活性的化合物，为治疗相关疾病提供新的药物靶点和治疗方案。
通过以上介绍，我们可以看到，在生物化学中的酶动力学研究方法方面，有多种不同的技术和手段可以帮助我们更好地理解酶的功能和调控机制。
生物化学实验2.血清丙氨酸氨基转移酶测定.专科
一、实验目的
1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定的原理和 方法
2.熟悉722G型可见光分光光度计的使用
二、实验原理
血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT），在37℃、pH7.4 的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊 二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
在足量底物作用下，生成产物越多表明酶活力越大， 酶浓度越高。一般以在一定时间内丙酮酸的生成量代 表血清ALT活力的大小
三、试剂和仪器
(一）试剂 1、 小牛血清 2、ALT底物液、2,4-二硝基苯肼溶液 0.4mol/L NaOH
(二）仪器 722G型可见光分光光度计、恒温水浴箱
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制（不做）。 2.血清ALT活力测定 取两支试管按下表操作：
试剂（ml）
测定管
对照管
血清
0.1
0.1
ALT底物液
实验二
血清丙氨酸氨基转移酶测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定
丙氨酸氨基转移酶（ALT）是体内最重要的转 氨酶之一，正常情况下，丙氨酸氨基转移酶主要存 在于各组织细胞中（以肝细胞中含量最多，心肌细 胞中次之），只有极少量释放入血，所以血清中此 酶活力很低。当这些组织病变、细胞坏死或通透性 增加时，细胞内的此类酶即可大量释放入血液中， 使血清中该酶活力显著增高。因此在患各种肝炎急 性病、药物中毒性干细胞坏死等疾病时，血清丙氨 酸氨基转移酶活力明显增高。
•从标准曲线上查出酶活力单位。
本法正常值：0~30单位。
注意事项
• 加完试剂需要将试管内溶液混匀 • 注意水浴的温度及时间 • 分光光度计的正确使用
• 【临床意义】
• 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于 阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发 性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。
生化实验报告_酶
实验名称：酶活力测定实验目的：1. 学习酶活力测定的原理和方法。
2. 掌握比色法测定酶活力的操作步骤。
3. 了解不同条件对酶活力的影响。
实验原理：酶是一种生物催化剂，具有高效、专一和可调节的特性。
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力，通常用单位时间内底物转化率或产物生成量来表示。
本实验采用比色法测定酶活力，通过测量酶催化反应过程中产生的颜色变化，计算酶活力。
实验材料：1. 试剂：底物溶液、酶溶液、缓冲液、3,5-二硝基水杨酸、NaOH、FeCl3、硫酸铜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、蒸馏水等。
2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管、试管架、烧杯等。
实验步骤：1. 配制底物溶液：- 取一定量的底物粉末，加入适量蒸馏水，溶解后定容至所需体积。
2. 配制酶溶液：- 取一定量的酶粉末，加入适量缓冲液，溶解后定容至所需体积。
3. 制备反应体系：- 取一定量的底物溶液，加入适量酶溶液，混合均匀。
4. 测定酶活力：- 将反应体系置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一定时间。
- 取出反应体系，加入适量3,5-二硝基水杨酸和NaOH，混合均匀。
- 在一定波长下测定吸光度值。
5. 计算酶活力：- 根据吸光度值和标准曲线，计算酶活力。
结果与分析：1. 标准曲线绘制：- 取不同浓度的底物溶液，分别加入酶溶液，进行反应。
- 在一定波长下测定吸光度值，以底物浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 酶活力测定：- 根据标准曲线，计算酶活力。
3. 不同条件对酶活力的影响：- 在不同温度、pH值、激活剂和抑制剂条件下，测定酶活力，分析不同条件对酶活力的影响。
讨论：1. 本实验采用比色法测定酶活力，操作简便，结果准确。
2. 不同条件对酶活力有显著影响，如温度、pH值、激活剂和抑制剂等。
3. 酶活力测定在生物化学、生物工程等领域具有重要意义，可用于酶的筛选、分离和纯化等。
结论：1. 通过本实验，掌握了酶活力测定的原理和方法。
临床生物化学检验-第8章 连续监测法测定酶活性
(amylase, AMY)
1. 以天然淀粉为底物的测定方法：可测定淀粉水解前后粘度或浊度的改变；也可测产物葡 萄糖；还可测定淀粉与某些活性染料的呈色反应（如碘淀粉比色法 ，但准确性和重复性都 较差）。
2. 以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法：底物的结构和相对分子量确定。
IFCC推荐法： EPS法：以4,6-亚乙基-4-硝基酚-“-D-麦芽七糖苷 (EPS) 做底物偶联多功能“-葡萄糖糖苷酶
9
“-
(alpha-L-fucosidase,AFU)
1. 以4-甲基伞形酮-“-L-岩藻糖苷为底物的荧光法： 灵敏度高 ，但需先用凝胶去除干扰物质。 2. PNPF法：以4-硝基苯-“-L-岩藻吡喃糖苷为底物经AFU水解释放4-硝基苯酚后 ，用碱性缓 冲液终止反应 ，使4-NP呈黄色的方法：需设样本空白并延长反应时间。
12
N-
(β-N-acetyl-D-glucosaminidase, NAG)
1. CNP-NAG法： 色原CNP解离常数 (PKa) 为 5.5 ，摩尔吸光系数大 ，可实现NAG的速 率法分析 ，无需设置样品空白 ，但底物的溶解性和稳定性较差。
2. PNP-NAG法：底物易得 ，反应速度快且稳定 ，是目前常用的方法。 3. MTP-NAG法：可用于尿液NAG测定 ，底物稳定 ，反应灵敏度高。
3. 连续监测法： CNP-NAG法、 PNP-NAG法、 MTP-NAG法。
测定原理： CNP-NAG NAG CNP + 氨基葡萄糖苷
PNP-NAG NAG PNP + 氨基葡萄糖苷
产物CNP、 MPT在405nm/ 340nm处的吸光度与NAG 的活性成正比。
MTP-NAG + H2O NAG N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖+ MPT (6- 甲基-2-巯基吡啶
生物化学实验中的酶活性测定方法研究
生物化学实验中的酶活性测定方法研究酶活性测定是生物化学实验中常用的一项重要技术。
酶是生物体内一类能加速生化反应速度的特殊蛋白质，酶活性的测定可以帮助研究人员了解酶的特性、功能以及代谢过程中的变化。
目前，常用的酶活性测定方法主要包括反应速率法、酶促循环反应法和光度法等。
反应速率法是一种常见的测定酶活性的方法。
该方法的原理是通过测定酶催化反应产物的形成速率来间接测定酶活性的大小。
常见的反应速率法包括滴定法、比色法和荧光法等。
滴定法是指将反应物溶液滴定到终点的时间来测定酶活性，通常用于测定酶对某种物质的水解反应。
比色法则是通过测定物质溶液在反应过程中产生的颜色变化来间接测定酶活性。
这种方法广泛应用于测定氧化酶和还原酶等酶的活性。
荧光法则是利用酶催化下的荧光反应来测定酶活性，其依赖于荧光的特性。
这种方法在生物化学实验中得到了广泛的应用。
除了反应速率法，酶促循环反应法也是常用的一种测定酶活性的方法。
该方法通过在酶反应系统中加入适当的底物和辅酶，通过连续的循环反应循环生成产物，最终通过测定产物的含量或浓度变化来计算酶活性。
酶促循环反应法通常用于测定双酶或多酶系统的活性，以及测定不同底物对酶活性的影响。
常见的酶促循环反应法包括循环色谱法、循环电位法和循环电位法等。
光度法是另一种常用的测定酶活性的方法。
光度法通过测量酶催化下反应溶液中溶质浓度的变化，并利用溶质浓度与光密度呈线性关系的特性来计算酶活性。
光度法通常需要选择适当的底物和染料，能够通过酶催化产生颜色变化或吸光度变化。
光度法广泛应用于测定氧化酶、还原酶、葡萄糖酶等酶的活性。
虽然这些测定酶活性的方法各有优劣，但都可根据实验需要灵活选择。
在进行酶活性测定时，还需要注意以下几点：首先，选择合适的底物和辅酶是测定酶活性的关键。
底物应该具有开展特性，能够与酶发生特定反应，最好是具有颜色变化、吸光度变化或荧光特性的物质。
辅酶则是为了提高酶的活性，通常用于那些需要辅酶参与的酶反应。
生物化学实验技术酶联免疫吸附剂测定法
酶联免疫吸附剂测定法
检测步骤：
ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，
然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳
性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在 质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半 个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。 由数值来判断结果的阴性或阳性。
形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。 复合物的形成量与待测抗原的含量成正 比。测定复合物中的酶作用于加入的底 物后生成的有色物质量(OD值)，即可确 定待测抗原含量。
双抗体夹心法
双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决 定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标 本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化
微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔式。ELISA板的特 点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计 上迅速读出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性增加。
酶联免疫吸附剂测定法
酶联免疫吸附剂测定法
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具 有酶促反应，显示出生物放大作用。在
ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶
基本原理：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免 疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶 标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使 固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量 与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有 色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进 行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测 定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各 种不同类型的检测方法。
大学生物化学实验中的酶活性测定方法
大学生物化学实验中的酶活性测定方法在大学生物化学实验中，酶活性测定是一个非常重要的实验项目。
酶是一种生物催化剂，它在生物体内起着至关重要的作用。
了解酶的活性对于研究生物体的代谢过程以及药物研发等领域具有重要意义。
本文将介绍一些常用的酶活性测定方法。
一、酶的活性测定原理酶的活性测定是通过测量酶催化下的反应速率来确定酶活性的。
酶活性的测定方法有很多种，其中常用的有比色法、荧光法和放射性同位素法等。
这些方法的原理都是基于酶催化下的底物转化反应。
二、比色法比色法是一种常用的酶活性测定方法。
该方法通过测量底物转化后所产生的产物的颜色强度来确定酶的活性。
比色法适用于那些底物转化后所产生的产物具有明显的颜色变化的酶反应。
比如，过氧化物酶（POD）催化底物苯酚和过氧化氢反应生成有色产物，可以通过测量产物的吸光度来计算酶的活性。
三、荧光法荧光法是一种基于酶催化下的底物转化反应产生荧光信号来测定酶活性的方法。
荧光法通常使用荧光素或荧光染料作为底物。
酶催化下的底物转化反应会导致荧光强度的变化，通过测量荧光强度的变化来计算酶的活性。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的优点，适用于那些底物转化后产生荧光信号的酶反应。
四、放射性同位素法放射性同位素法是一种利用放射性同位素标记底物来测定酶活性的方法。
该方法通过测量底物转化后所产生的放射性同位素的放射活性来计算酶的活性。
放射性同位素法具有高灵敏度和高精确度的优点，但由于放射性同位素的使用，需要特殊的实验条件和设备。
五、其他方法除了上述介绍的比色法、荧光法和放射性同位素法外，还有许多其他的酶活性测定方法。
例如，电化学法利用电化学传感器测量底物转化后所产生的电流变化来测定酶活性；质谱法通过测量底物转化后所产生的质谱图谱来计算酶的活性。
这些方法各有特点，适用于不同类型的酶反应。
六、实验注意事项在进行酶活性测定实验时，需要注意以下几点。
首先，要选择合适的底物和催化剂，并控制实验条件，确保反应的可重复性。
生化实验04-淀粉酶活性的测定
生化实验04-淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定是一种重要的生物化学检测，其基本原理是用淀粉作为底物，利用酶介导的过程，将淀粉水解成低聚糖，并通过苯二酚(Folin-Ciocalteu法)测定反应，形成羟基苯并联二肽，从而可以准确测定淀粉酶活性。
该检测方法的特别之处在于无需半乳糖基转化，能直接检测细胞内活性淀粉酶。
本实验采用淀粉酶活性的测定来反映样品内活性淀粉酶的含量和性质。
实验原理淀粉酶活性的测定主要是利用酶促反应，将淀粉水解成支链水解物，此过程会改变样品中反应物的形态和特性，从而通过苯二酚(Folin-Ciocalteu法)测得淀粉酶的活性。
该反应是将样品与Folin－Ciocalteu反应液混合，使反应液中的苯二酚与水解后的淀粉低聚糖发生反应，形成羟基苯并联二肽，这些二肽经过光度测定能独立出来，最后得到淀粉酶活性的测定结果。
实验步骤1. 准备试剂a) 苯二酚 Folin-Ciocalteu反应液：将250毫升2.5mol/L碳酸钠溶液加入50毫升10mol/L硫酸钠溶液，搅混，然后加入90毫升1mol/L硫酸钾溶液，苯二酚Folin-Ciocalteu反应液准备完毕。
b) 反应系统：放入1.0 ml淀粉溶液，0.2 ml苯二酚Folin-Ciocalteu反应液，0.8 ml缓冲液，搅拌均匀即可。
2.淀粉酶活性的测定:a) 将反应系统中放入多余的样品添加到实验管中，转移到光度仪中进行测定，观察测定结果。
b) 计算淀粉酶活性指数：以质量发射率550nm处的发射峰值为参考标准，按照公式计算淀粉酶活性指数。
应用淀粉酶活性的测定在非植物细胞（如固氮细菌、氨基酸分解的细菌）中也广泛应用。
淀粉水解系统有助于研究和控制细胞内的淀粉合成与消耗，从而洞察活动的工程机制，帮助揭示物质的重要功能以及研究物质之间的相互作用。
由于其易处理，快速，稳定，准确，淀粉酶活性测定技术，广泛应用于药物研究和药物质量控制，生物燃料，环境污染检测，食品检测，生物技术，等等。
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确定线性时间，然后在这段时间进行测定， 避开延滞期和一级反应。
连续监测法
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连
续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物 量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间 接计算酶活性浓度的方法。
连续监测法的测定时间
注意事项
自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，
自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于 自动化仪器。 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定 酶活性浓度最常用的方法。
底物或产物浓度的检测
底物或产物浓度的检测
在酶活性测定方法中，无论是定时法还是连续
监测法，酶促反应速度都要通过测定底物或产 物来实现。 依据酶促反应中底物或产物的理化特性质及检 测方法，酶活性浓度测定的方法可分为直接法 和间接法。
酶催化活性的途径
酶催化活性可通过测定酶促反应过程中单位时
间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶 促反应的速率来获得。 用这种方法获得的酶浓度的确切名称是“酶的 催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。
酶活性与反应速率的关系
若[S]>>Km，且[S]很大，米-曼氏方程式可简
化为：
V K p[ E ] 此时，酶促反应的最大速度只与酶催化活性或
基于人工合成色素原底物理化特 性的测定方法
一些水解酶类或转移酶类可通过酶促反应将化
合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底 物转变为有颜色的产物。人们把这类底物称为 “色素原”底物。根据这一原理，人们设计合 成了一系列底物用来测定酶活性。
间接法
间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征
性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化 反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性 质的另一个化合物，然后进行测定的方法。
方法。即在原反应体系中加入另一些酶试剂， 将所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。 在临床常规酶学分析中，以NAD（P）H为辅 酶或辅基的脱氢酶，以及过氧化物酶（POD） 是常用的酶偶联法的酶试剂。
酶偶联反应法
酶偶联反应式
A B C p
Ex Ea Ei
酶偶联反应法的基本原理
或酶活性浓度的酶称为工具酶。 常用的工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水 解酶类，但以氧化还原酶类更多见，因为其产 物最易被直接监测而成为指示酶。
共通反应途径
在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往
使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所 谓共通（或通用）反应途径。
两类常用的通用反应途径
酶量[E]成正比例，
它是建立准确、可靠测定方法的基础。
酶促反应过程的分期
一个典型的酶促反应过程一般包括三个阶段。 延滞期（lag phase）、 线性期（linear phase）
非线性期（non linear phase）
酶促反应时间进程曲线
注意事项
要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率
和时间的关系， 找出酶促反应速率恒定的时间， 避开延滞期、非线性反应期。 传统的手工分析法无法在零级反应期测定，故 结果不够准确。
酶活性浓度的测定方法
酶活性浓度的测定方法
以反应时间为依据，酶活性浓度测定方法可分
为两大类
定时法（fixed time assay） 连续监测法（continuous monitoring assay）
直接法
这类方法是在不终止酶促反应条件下，通过特
殊的仪器直接测定反应体系中底物或产物的理 化特性变化量， 如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度 等，从而计算出酶活性浓度的方法。
基于NADH或NADPH理化特性 的测定方法
利用NAD(P)H在340nm处的吸光度值的变化，
测定各种脱氢酶的活性，该法是目前应用最广 的一类方法。
本节内容
一、酶活性浓度的测定 二、酶质量浓度的测定 三、同工酶及其亚型测定
四、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制
酶活性浓度的测定
主要内容
酶活性浓度测定的基本原理 酶活性浓度的测定方法 底物或产物浓度的检测
酶偶联反应法
工具酶与共通反应途径 酶活性浓度的单位
酶活性浓度测定的 基本原理
在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测
定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即 在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测 酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产 物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达 到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待 测酶的活性。
酶偶联反应法的反应进程
用酶偶联法测定酶活性浓度时，酶促反应进程
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
存在四个时相： ①预孵育期或预温期。 ②延滞期。 ③稳态期或恒态期。 ④非恒态期。
酶偶联法的吸光度变化示意图
注意事项
应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，
因为只有恒态期才能代表酶活性。 只有此阶段的吸光度才会有明显线性变化。
工具酶与共通反应途径
工具酶
在酶学分析中，作为试剂用于测定化合物浓度
NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应 偶联H2O2的工具酶及其指示反应
酶活性浓度的单位
酶活性浓度的单位
tal单位; 酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数 表示。U/L。
酶活性浓度单位
正常上限倍数
化学法
大多数是在酶促反应终止后加入另一个试剂与
底物或产物反应，转化为有色化合物，再用分 光光度法检测。 部分酶类是在原来反应体系中加入一些与酶促 反应无关的试剂，这些试剂只和酶促反应的某 一反应物迅速作用，产生可被仪器检出的有特 征性物质，但同时又不和酶作用也不影响酶活 性。
酶偶联法
是目前在酶活性测定中应用最多，最为广泛的