WesternBlot实验步骤及注意事项(精)

western blot的实验步骤及注意事项

一、实验步骤

1. 缓冲液配制

(1 Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol （临用前加）,ddH2O to 1L

(210×TBS: 1 M Tris·HCl （pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L

(3TBST: 1×TBS 中加入1/1000的Tween

(4封闭液：脱脂奶粉5%(w/v,用TBST 配制

2. SDS-PAGE

电泳电压：积层胶电泳电压80V 左右，分离胶电泳电压110V~120V

3. 免疫印迹

(1 SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张 Whatman 3mm滤纸和1张PVDF 膜，与凝胶大小相符合。将PVDF 膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。

(2 将凝胶及PVDF 膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF 膜、3层滤纸逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。

(3 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。

(4 以1/1000的比例，加入5 μL 第一抗体，4 ℃温育过夜。

(5 TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。

(6加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL 第二抗体，温育1 h。

(7 TBST溶液洗膜5min ，轻倒，重复3次。

(8加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。放入夹板中。

(9配制显影液和定影液。暗室操作：将X 光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。

二、注意事项

1. 在Western 实验中，通常有人采用TBS ，有人采用PBS ，能否有人解释一下二者在使用中的区别？

选择合适的缓冲液对于维持一定PH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS 的缓冲能力强于TBS （因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS 在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS 易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS ；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选

PBS 。

Western blot中使用TBS 和PBS 均可，只是要根据需要选择合适的浓度。

2. 没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用来做Western blot吗？

不一定, 因为有的抗体是识别线性表位的, 有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。

3. 做Western 每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western 在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL

显色、压片、洗片。

4. Western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF 好还是NC 膜，能介绍一下膜的

选择吗？

PVDF 膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF ，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。都可以用丽春红染

色。具体使用还要参考相关文献。

5. 为什么出现了多条带, 每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律, 为什么? 是封闭时间不够吗, 请指教 .做WESTERN 必须要内参吗？

一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化, 而内参的条带基本均匀一致. 这样才有说服力, 表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化. 所以严格意义上说, 内参是必须做的。

6. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白

质和NC 膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转

移膜，或使用小孔径的NC 膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。

7. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么？

DAB 显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB 的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。

8. 酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？

免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶标记已知抗体(或抗原，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。

免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。