实时荧光定量PCR具体实验步骤

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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。

二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。

1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。

计算好所有引物和SYBgreen
的用量。

2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。

4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。

上机。

实时荧光定量PCR技术

千里之行，始于足下。

Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。

染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。

荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。

目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。

二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。

2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。

3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。

4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。

三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。

荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用

实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。

PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。

实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。

反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。

2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。

PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。

循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。

3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。

4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。

5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。

比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。

实时qPCR具有广泛的应用。

1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。

2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。

3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。

4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。

实时荧光pcr实验操作流程

实时荧光pcr实验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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荧光定量pcr实验步骤

荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。

本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。

一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。

2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。

确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。

二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。

可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。

2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。

使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。

确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。

三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。

2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。

注意保持反应管的清洁和无菌。

3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。

根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。

四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。

通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。

2. 启动PCR反应，开始扩增。

在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。

五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。

根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。

2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。

通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。

二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。

2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。

倒入凝胶板上凝固30min。

2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。

3．120V电压下电泳25min。

用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

4．RNA电泳结果如下图所示。

可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。

四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul 体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃60min ，70℃10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6.正式定量实验：对所有样品上机检测；7.实验结果和数据分析，形成报告。

收费标准优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）技术原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

实时荧光定量PCR技术实验操作流程

实时荧光定量PCR技术实验操作流程
1.RNA提取：
针对茎环状结构RT引物，RNA正常提取就好;对于Oligod(T)特异的RT引物，尽量用特殊试剂盒提取miRNA。

2.反转录：
反转录过程对酶没有特殊要求，操作按照反转录酶的说明书进行。

对于引物，在反转录过程中只需加入Oligod(T)特异的RT引物或茎环状结构RT引物，不需要另外添加其他RT引物。

用Oligod(T)特异的RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。

内参基因不需要单独设计RT引物，可以用荧光定量PCR的反向引物作为RT引物。

3.荧光定量PCR：
先优化PCR体系(引物浓度、退火温度等)，进行引物测试，确保扩增曲线正常且溶解曲线为单一的尖峰，阴性对照无扩增，则引物测试合格，再进行后续实验(常规操作)。

实时定量PCR的操作流程

实时定量PCR的操作流程1.模板DNA的制备：-确定DNA的浓度和纯度：使用比色法或分光光度计测量DNA的浓度和纯度，确保样品合适的质量。

-稀释DNA：根据实验要求，将提取到的DNA稀释到适当的浓度。

2.引物和探针的设计：-引物的设计：根据目标基因序列，使用专业的引物设计软件设计引物序列。

引物应该具有高特异性，避免产生非特异性扩增产物。

-控制引物的浓度：根据实验要求，按照引物设计软件的建议稀释引物到适当的浓度。

-探针的设计：如果实验需要使用探针，可以根据引物序列设计探针。

3.试剂的准备：- 制备反应混合物：根据实验要求，准备反应混合物的MasterMix。

MasterMix包括PCR缓冲液、引物、探针（如果需要）、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、酶（如Taq DNA聚合酶或其他热稳定DNA聚合酶）和其他辅助试剂（如MgCl2）。

根据实验要求和厂家推荐，确定每个试剂的最佳浓度。

-分装反应体系：将反应体系中的每个试剂分装到PCR管或板中，确保每个样品得到相同的试剂组成。

4.PCR反应条件设定：-温度梯度实验：使用目标基因的引物，在不同温度下进行PCR反应，确定最佳的退火温度。

-内参基因选择：选择适当的内参基因作为标准来对目标基因的表达进行定量。

内参基因应在样品中稳定表达，并且在PCR反应中和目标基因的扩增效率类似。

-标准曲线制备：制备一系列已知浓度的目标基因的标准品，使用这些标准品进行PCR反应，生成标准曲线。

5.PCR反应设定：-加入模板DNA：向每个反应管或孔加入相应量的模板DNA。

-加入反应混合物：向每个反应管或孔中加入相应量的反应混合物。

-充分混合：使用震荡器或轻轻的摇晃混合反应体系中的试剂。

6.PCR反应条件设定：-快速融合：将PCR板或管置于预热的PCR仪中，加热到融解温度，通常为95°C。

-循环扩增：设定一系列退火、延伸和扩增周期，根据实验要求和引物设计软件的建议进行设定。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。

下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。

1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。

2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。

3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。

反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。

4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。

实时荧光定量PCR操作指南

实时荧光定量PCR操作指南实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、病毒检测、疾病诊断等领域。

本文将为您提供一份详细的实时荧光定量PCR操作指南，以帮助您正确高效地进行实验。

一、前期准备1.仪器准备确保实时荧光定量PCR仪的工作状态正常，能够提供稳定的温控和荧光检测功能。

2.试剂准备准备好使用的引物和探针、反转录酶、核酸模板、PCR酶、荧光探针等试剂，并按照相关说明进行稀释和储存。

3.实验室操作保持实验室环境清洁整洁，确保试剂和样品不受外界污染。

佩戴实验手套和口罩，避免DNA污染。

二、PCR体系设置根据您的实验目的和试剂系统的要求，设置PCR反应的体积和组分。

1.配置PCR体系a.将反向转录试剂盒中的试剂按照说明书中的比例进行配置，包括引物、探针、反转录酶、核酸模板等。

b.添加核酸模板到体系中，确保模板的质量和浓度适合实验要求。

c.添加合适的PCR酶，如Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶等。

d.添加稀释的胶原酶。

2.装管设置a.在无菌条件下，将PCR反应体系分装至PCR管中。

b.避免气泡的产生，确保体系均匀混合。

三、PCR参数设置根据实验需求和试剂系统的建议，设置PCR反应的温度和时间参数。

1.反转录步骤a.按照试剂盒说明书的建议，设置反转录温度和时间。

常见的反转录参数为42℃，60分钟。

2.PCR扩增步骤a.设置初始变性温度和时间。

常见的初始变性参数为95℃，5分钟。

b.设置PCR循环数和每个循环的温度和时间。

常见的PCR循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟，共40个循环。

c.设置荧光检测温度和时间。

根据荧光探针的特性，设置合适的温度和时间窗口。

四、数据分析和结果解读1.数据采集实时荧光定量PCR仪会自动记录荧光信号和温度变化数据，确保您保存这些数据供后续分析和结果解读使用。

qpcr的操作流程

qpcr的操作流程
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、准确的分子生物学技朧，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。

下面将介绍qPCR的操作流程。

1. 样品处理：首先需要从样品中提取RNA或DNA，并进行适当
的纯化处理。

确保提取的核酸质量和浓度符合实验要求。

2. 质控检测：对提取的核酸进行质控检测，包括测定纯度、浓
度和完整性。

确保核酸的质量符合实验要求。

3. 反转录：对RNA进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。

反
转录反应需要使用逆转录酶和引物，确保反转录产物的质量和完整性。

4. 准备qPCR反应体系：根据实验设计和引物设计，准备qPCR
反应体系。

包括模板DNA或cDNA、引物、探针、核酸酶、缓冲液等。

确保反应体系的配比准确。

5. 进行qPCR反应：将准备好的反应体系加入到qPCR仪器中，
进行PCR扩增反应。

根据实验设计和引物特性，设置合适的PCR程
序和参数。

6. 数据分析：分析qPCR反应的数据，包括计算Ct值、绘制标
准曲线、计算目标基因的相对表达量等。

确保数据的准确性和可靠性。

7. 结果解读：根据数据分析结果，解读实验结果。

判断目标基因的表达水平、基因型等信息，为后续实验和研究提供参考。

总的来说，qPCR操作流程包括样品处理、质控检测、反转录、准备反应体系、进行PCR反应、数据分析和结果解读等步骤。

通过严格的实验设计和操作规范，可以获得准确、可靠的实验结果，为分子生物学研究提供重要的数据支持。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。

可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。

2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。

3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。

4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。

5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。

6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。

注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。

7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。

8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。

9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。

根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。

10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。

11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。

常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。

12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。

13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。

实时荧光定量PCR仪操作流程

实时荧光定量PCR仪操作流程实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种常用的分子生物学实验仪器，用于定量检测DNA或RNA样本中的特定序列。

通过对PCR反应进行荧光检测，可以实时监测目标序列的扩增过程，并且具有高灵敏度和高特异性的优势。

下面将介绍实时荧光定量PCR 仪的操作流程，以帮助您正确进行实验。

1. 准备工作在开始实时荧光定量PCR实验之前，需要准备以下实验器材和试剂：（1）实时荧光定量PCR仪：确保仪器已预热至适当的温度；（2）PCR反应管或板：根据实验需要选择适当的规格；（3）PCR试剂盒：包括DNA模板、引物、探针、酶等；（4）DNA/RNA样本：按照实验设计合理稀释或提取，确保样本质量良好；（5）聚合酶链式反应混合液（PCR Mix）：根据试剂盒说明配置混合液。

2. 操作步骤（1）设置PCR仪参数：将需要的实验参数输入PCR仪中，包括扩增阶段的温度、时间和循环次数等。

（2）制备PCR反应体系：按照试剂盒说明书中的配方将PCR Mix、DNA模板、引物和探针等加入PCR反应管或板中。

（3）密封反应管或板：确保反应管或板密封良好，避免样品蒸发或污染。

（4）放入PCR仪：将密封好的PCR反应管或板放入PCR仪中，确保仪器已预热至适当的温度。

（5）运行实验：启动PCR仪，开始实时荧光定量PCR反应。

仪器会根据设置的参数自动进行温度循环和荧光信号监测。

（6）数据分析：实验进行过程中，可以通过PCR仪的软件实时监测扩增曲线和荧光信号，获得相关的实验数据。

（7）结果解读：根据实验目的和结果，对荧光信号和扩增曲线进行分析和解读，获得所需的定量PCR结果。

3. 注意事项（1）实验操作应按照严格的无菌操作要求进行，避免PCR反应受到外部污染。

（2）实时荧光定量PCR仪涉及的试剂和标本具有一定的生物安全风险，应按照相关安全规范进行操作和处理。

（3）准确的数据记录和标注是保证实验结果可靠性的重要环节，务必在实验过程中进行详细记录。

实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR详细操作步骤1.准备试剂和样品a.预先准备PCR反应混合溶液包括引物、探针、酶和缓冲液的混合物。

b.从样品中提取RNA或DNA，并在低温下保存以避免降解。

c.根据需要进行RNA或DNA的定量和纯化。

2.设计引物和探针a.根据目标序列设计引物和探针。

b.引物应具有适当的长度、GC含量和熔点。

c. 控制探针以与目标序列选择相应的荧光染料，如SYBR Green或TaqMan探针。

3.准备反应混合物a.在无菌条件下将PCR反应混合物配制到适当的反应管中，每个反应管中包含适当浓度的引物、探针和模板DNA。

b.避免反应管中引物和探针暴露在光下。

c.快速离心反应管以使反应物沉入管底。

4.设置PCR程序a.启动PCR仪，设置反应条件，包括温度、时间和周期数。

b.通常，PCR程序包括初始化步骤，如酶激活和DNA解链，随后进行多个循环，每个循环包括DNA扩增和荧光信号检测步骤。

5.进行PCR扩增a.将反应管置于PCR仪中，在适当的温度下进行PCR扩增。

温度通常在95°C和60°C之间变化。

b.扩增过程中会产生新的DNA分子，PCR仪的热循环可使目标序列按指数方式扩增。

6.监测荧光信号a.在每个循环的特定温度下，荧光信号被激活，并通过PCR仪的探测系统检测。

b.荧光信号的大小与含有荧光标记分子的DNA分子数量成正比。

7.分析数据a.在扩增过程中记录每个循环的荧光信号。

b.使用PCR仪的软件分析数据，生成标准曲线，计算目标序列的相对丰度。

8.结果解释a.使用阈值循环数（Ct）来表示目标序列在每个样本中的相对丰度。

b.相对丰度可以通过与参照基因进行相对定量或通过绝对定量法计算获得。

总结：实时荧光定量PCR是一种准确量化DNA、RNA和蛋白质的方法，它包括准备试剂和样品、设计引物和探针、准备反应混合物、设置PCR程序、进行PCR扩增、监测荧光信号、分析数据和结果解释等步骤。

通过qPCR，我们可以准确测量目标序列的相对丰度，并在许多生物学研究和诊断领域中发挥重要作用。

实时荧光定量PCR操作步骤

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH25分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。

样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

实时荧光定量pcr的方法

实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于精确测量DNA 或RNA样本中特定目标序列数量的分子生物学技术。

该方法结合了传统PCR 技术和荧光探针技术，可以在PCR反应过程中实时监测和定量特定目标序列的扩增量。

实时荧光定量PCR的步骤如下：
1. 准备反应体系：包括特定目标序列的引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、酶和DNA模板。

2. PCR反应：将反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。

PCR过程中，引物与DNA模板结合，酶进行DNA合成，目标序列得到扩增。

3. 荧光探针监测：在PCR反应中，荧光探针与目标序列结合，产生荧光信号。

实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的强度。

4. 数据分析：实时荧光定量PCR仪会根据荧光信号的强度，通过计算机算法来计算目标序列的起始数量。

可以利用标准曲线法或相对定量法进行数据分析，得到目标序列的绝对或相对数量。

实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和广泛线性范围等优点，
广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因表达分析等领域。

实时定量PCR步骤

实时定量PCR步骤实时定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA序列或基因表达水平的方法。

它是PCR技术的变体，可以实时监测PCR反应的进行，并在放大过程中定量目标DNA序列的数量。

下面是实时定量PCR的详细步骤：步骤1：实验准备1.1收集所需的实验材料，包括PCR反应液组分（引物、探针、dNTPs、缓冲液、聚酶等）、PCR管和盖膜、模板DNA样品、阳性和阴性对照样品等。

1.2预先冷藏和解冻所有的试剂和样品。

1.3清洁操作台面，并准备离心机、实时荧光PCR仪和计算机等设备。

步骤2：引物和探针设计2.1根据待测目标序列，使用生物信息学工具设计引物和探针，确保具有高度特异性和高扩增效率。

2.2检查引物和探针的熔解温度是否相近，并避免二次结构和杂交问题。

步骤3：制备PCR反应液3.1根据PCR反应体系计算所需的试剂量，并根据实验板的数量和样品数量，按比例制备PCR反应液。

3.2在一个干净的离心管中，将缓冲液、dNTPs、引物、探针、酶和染料等反应组分按照特定顺序加入。

3.3使用纯水调整总反应体积，确保每个样品反应液体积相等。

步骤4：添加模板DNA4.1准备好模板DNA样品，可以是基因组DNA、cDNA或其他。

4.2将模板DNA分别加入各个PCR反应管中，注意避免污染和交叉污染。

步骤5：进行PCR反应5.1将PCR反应管密封，并在PCR仪上进行扩增。

此时，PCR仪应可提供实时荧光信号监测功能。

5.2设置PCR仪的温度程序和循环次数，通常包括热激活、扩增和延伸等不同的阶段。

5.3监测PCR仪上的实时荧光信号，并记录下所有的扩增曲线。

实时荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。

5.4在每个PCR循环的结束时，建议进行一次熔解曲线分析，以确定PCR产物的特异性。

步骤6：数据分析6.1使用PCR仪上的软件工具，导出扩增曲线数据。

6.2使用阈值周期（Ct）方法，根据扩增曲线与阈值线的交叉点来定量反应液中目标序列的数量。

实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR详细操作步骤1.实验前准备a.首先，准备所需的引物和探针。

引物是用于扩增待测DNA或RNA序列的短链DNA片段，而探针是荧光标记的DNA分子，用于标记和检测扩增产物。

可以使用商业引物和探针，或者设计自定义的引物和探针。

b.准备样品。

样品可以是DNA或RNA提取物，也可以是cDNA反应产物。

确保样品的质量和纯度，避免污染和降解。

c. 准备Master Mix。

Master Mix是一个预混合的反应液，包含引物、探针、核酸酶、逆转录酶、聚合酶和其他所需的试剂。

根据实验设计确定Master Mix的配方和浓度。

2.反应管设定a. 将适量的Master Mix加入每个反应管中。

根据实验设计，确定每个反应管中所需Master Mix的体积。

b.加入适量的模板DNA或RNA溶液。

根据实验设计，确定每个反应管中所需模板溶液的体积。

c.加入适量的引物和探针。

根据实验设计，确定每个反应管中所需引物和探针的体积。

d.加入适量的缓冲溶液和其他试剂。

根据实验设计，确定每个反应管中所需缓冲溶液和其他试剂的体积。

3.PCR程序设定a.设定PCR程序。

根据引物和探针的特性，确定PCR程序的温度和时间参数。

通常包括一个初始变性步骤（95°C，5分钟），40个循环的扩增步骤（95°C，30秒；温度调节，30秒；扩增，30秒-1分钟），以及最终的降温步骤（4°C或25°C）。

b.设定数据采集方式。

实时荧光定量PCR系统可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，并实时记录和分析数据。

根据实验设计和PCR程序，选择合适的数据采集方式，在合适的时间点记录荧光信号。

4.实验操作a.将反应管安置在实时荧光定量PCR仪中。

确保反应管正确放置在PCR仪的样品槽中，并密封好。

b.启动PCR程序。

根据PCR仪的操作说明，启动PCR程序并开始反应。

c. 监测PCR反应过程。

实时观察PCR反应过程中的荧光信号变化。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞.室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿.盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后.15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相.中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA.混匀后15到30℃孵育10分钟后.于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液.每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙O配制）.清洗RNA沉淀。

混匀后.4℃下7000rpm离心5分醇（75%乙醇用DEPCH2钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液.使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时.先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次.使其完全溶解.获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后.读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值.测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。

样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中.取5ul.1:100稀释至495µl的TE中.测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用来测量以后.剩余样品RNA为35 µl.剩余RNA总量为：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度.比值范围1.8到2.1。