双光子成像的范围
双光子共振条件-概述说明以及解释
双光子共振条件-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述双光子共振是一种重要的光学现象，它涉及到光子之间的相互作用过程。
在这种过程中，两个光子同时被吸收或发射，产生强烈的相互作用效应。
这种共振条件是一种非线性光学效应，能够在很多领域中得到广泛应用。
双光子共振的研究始于20世纪初，当时科学家们对光子的特性和行为进行了深入的探索。
通过实验观察到，当两个光子的能量级别相当时，它们之间存在相互作用的可能性。
而当两个光子的能量差距较大时，它们之间的相互作用将会很弱，难以观测到明显的效应。
随着技术的不断进步，科学家们能够更加精确地研究和控制光子的行为。
他们发现，在特定的条件下，双光子共振可以被放大到极高的程度。
这种现象不仅具有理论上的意义，还有着重要的应用价值。
在目前的研究中，双光子共振已经在多个学科领域中得到了广泛的应用。
例如，在量子光学中，双光子共振被用于制备具有特殊量子态的光子对。
在分子光谱学中，双光子共振可以用来研究分子的结构和动力学过程。
此外，双光子共振还被应用于光学成像、材料科学等领域。
本文将系统地介绍双光子共振的定义和原理，并详细讨论双光子共振的条件以及其应用和未来发展。
通过对这一现象的深入研究，我们可以更好地理解光子之间的相互作用过程，为未来的科学研究和技术应用提供有力支持。
文章结构部分的内容可以这样来写：1.2 文章结构本文将围绕双光子共振条件展开讨论，内容主要分为三个部分：引言、正文和结论。
在引言部分，我们将对双光子共振进行概述，介绍其定义和原理，并阐明本文的目的。
正文部分将重点探讨双光子共振的条件。
首先我们将详细解释双光子共振的定义和原理，为后续的条件探讨打下基础。
然后，我们将在2.2和2.3两小节分别讨论双光子共振的条件一和条件二，深入探究它们的具体要求和实现方式。
在结论部分，我们将总结双光子共振的条件，强调其重要性和应用前景，并展望其未来的发展潜力。
同时，我们还将提出一些关于双光子共振应用的展望，为读者提供更多的思考和探索方向。
双光子显微镜的应用优势与维护要素
综 述①中山大学中山医学院科研仪器中心 广东 广州 510080*通信作者：**************作者简介：李娟，女，(1983- )，硕士，助理实验师，从事科研仪器共享服务与管理工作。
中国医学装备2021年12月第18卷第12期 China Medical Equipment 2021 December V ol.18 No.12双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜及双光子激发技术的一种新精密仪器。
在激光扫描显微镜的基础上，双光子显微成像技术以红外飞秒激光作为光源，受散射影响较小，易穿透样本，可深入组织内部非线性地激发荧光，减小激光对生物体的损伤，光毒性小且具有高空间分辨率，适合生物样品的深层成像及活体样品的长时间观察成像[1-2]。
双光子显微镜已成为生命科学各领域重要的研究工具，可在细胞甚至是亚细胞水平对活体动物的神经细胞形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象进行直接的长时间成像监测，还能进行光激活染及光损伤等光学操纵，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究。
通过阐述双光子显微镜的工作原理、样品前期准备、成像难点及设备使用及日常维护要点，梳理双光子激光共聚焦与其他同类成像类设备在成像原理、配置参数、成像特点及应用领域等方面的不同，为使用者提供更多实验方法参考，使之更好地服务于医学临床、教学和科研。
1 双光子显微镜成像技术原理、优势及应用范围1.1 双光子激发技术的基本原理双光子激发理论由诺贝尔奖得主Goppert Mayer于1931年提出，1961年得到了实验验证[3-4]。
该技术的基本原理是：在高光子密度情况下，荧光分子可同时吸收2个长波长的光子，其效果与使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子相同。
长波长的光受散射影响小于短波长的光，易穿透标本；长波长的近红外光对细胞毒性小于短波长的光。
此外，双光子激发要较高的光子密度，为不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器，激光具有高峰值能量及低平均能量，物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜焦点处的光子密度最高，故双光子激发只发生在物镜的焦点处，只有在焦点平面上才有光漂白及光毒性，所以双光子显微镜无需共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
1700nm波段活体小鼠皮肤二光子成像技术研究
分类号O437 学校代码10590 U D C535 密级公开深圳大学硕士学位论文1700 nm波段活体小鼠皮肤三光子成像技术研究学位申请人姓名贺晨专业名称光学工程学院（系、所）物理与光电工程学院指导教师姓名王科教授摘要多光子显微成像技术作为一种综合了毫米级成像深度以及亚细胞级别分辨率的成像工具，在活体动物及其组织的成像研究中得到了非常广泛的应用。
不过传统的双光子显微成像技术由于信号背景比极限的缘故极大地限制了成像深度。
科学家们通过自适应光学以及更换成像波长等策略一直未能在成像深度上取得较大进展。
直到2013年康奈尔大学的Xu课题组开发出1700 nm窗口三光子成像技术突破了以往双光子成像在的深度限制。
尽管此技术在脑成像中已得到了极为成功的应用，可是其能否在皮肤中实现同样可观的成像深度以及能得到何种程度的应用依然未知。
因为皮肤组织与大脑组织十分不同：相比于皮肤，大脑的组织更加均匀，且透过率更高。
而皮肤组织高度散射，分层复杂，仅表皮下20μm的范围内就有四种细胞层；再加上皮肤表面凹凸不平，还有毛孔的存在，这都会引入显著的像差。
因此该技术是否适合深层皮肤成像仍然未知。
针对此问题我们的工作主要集中在以下几点：1. 开发简易、无损的小鼠皮肤视窗制作技术：由于以往固定小鼠皮肤视窗时主要采用将金属环缝制在小鼠皮肤上的策略，但这样一来势必会给小鼠皮肤带来损伤。
因此我们将缝制的策略改为以牙科水泥作为粘合剂粘连的策略，在成功避免了对小鼠的损伤的同时也能够满足视窗稳定性的要求。
2. 活体小鼠皮肤波长对比：为了实现长短波长在皮肤多光子成像中的对比实验，我们设计了双色飞秒脉冲光源。
利用一台中心波长为1550 nm的飞秒脉冲激光器作为泵浦光源分别激发棒状光子晶体光纤产生1700 nm波段的孤子，以及倍频晶体产生二次谐波。
并利用这套系统证明了1700 nm波段优于800 nm波段的深层成像能力。
3. 测量与计算不同浸润介质的基本参数：利用“粗糙表面”的技术分别测出了三种多光子成像常用的浸润介质：硅油、矿物油、F30CC的从400 nm到1680 nm的折射率；随后使用软件Origin拟合出8参数的Sellmeier公式，并一次计算出以上三种浸润油的反常色散与三阶色散，为多光子皮肤成像浸润介质的选取提供了依据。
细胞内钙离子浓度及过程的可视化研究
细胞内钙离子浓度及过程的可视化研究细胞内钙离子（Ca2+）是一种重要的信号分子，它参与了多种细胞过程，包括细胞增殖、代谢、分化和凋亡等。
钙离子的浓度变化可以引发多种信号通路的激活和抑制，而这一过程的精确测量和研究一直是生物学研究的热点之一。
为了研究细胞内钙离子浓度及其变化的过程，科学家们发展了一系列可视化技术，并不断地改进和完善。
以下将对这些技术进行介绍和探讨。
1. 荧光探针荧光探针是一种常用的细胞内钙离子浓度测量技术。
它基于荧光物质在钙离子存在下的荧光强度变化来反映细胞内钙离子浓度的变化。
目前，常用的荧光探针有Fura-2、Fluo-3、Rhod-2等。
这些探针具有灵敏度高、响应速度快、使用方便等优点，并且可以在单个细胞层面进行测量，从而反映细胞内钙离子浓度的局部变化。
但是，荧光探针也存在一些缺点，例如探针本身的毒性、荧光信号受到细胞内环境的影响等。
2. 光学成像技术光学成像技术是一种可以在细胞内实时观察钙离子浓度变化的技术。
它包括单细胞成像、双光子成像、多光子成像等不同的方法。
其中，单细胞成像可以在单个细胞的水平上观测钙离子的变化，但是受到成像区域的限制。
而双光子成像和多光子成像可以在更大的区域内进行成像，但是需要更高的设备成本和技术水平。
无论哪种方法，光学成像技术都具有高时间分辨率、高分辨率、高活细胞成像等优点，并且可以提供非常直观的瞬态钙信号。
3. 基因编辑技术基因编辑技术可以用来研究细胞内钙离子的调节机制。
通过基因编辑技术，可以实现精确地修饰特定的靶基因，从而观察对应的生物学变化。
例如，可以使用CRISPR/Cas9技术对钙离子通道进行编辑，观测其对钙离子信号传递的影响。
4. 蒙古花生素受体技术蒙古花生素受体技术是一种可以研究钙离子信号传递通路的技术。
基于该技术，研究人员可以精确地操纵细胞内的蒙古花生素受体，从而调节钙离子的浓度变化和传递通路。
该技术可以模拟细胞内钙信号的变化，从而深入地研究钙离子信号传递的机制。
双光子吸收的近红外光_解释说明以及概述
双光子吸收的近红外光解释说明以及概述1. 引言1.1 概述双光子吸收是近红外光谱学中的重要研究方向之一，近年来得到了广泛关注和研究。
近红外光指的是在700到2500纳米波长范围内的光，具有较深的组织穿透能力和较低的组织散射能力。
而双光子吸收则是指两个光子同时被物质吸收的现象，与常见的单光子吸收不同。
本篇文章将对双光子吸收的近红外光进行解释说明，并概述其相关内容。
从近红外光的定义与特性开始，介绍双光子吸收现象的基本原理，接着探讨了近红外双光子吸收在不同应用领域中的潜在前景。
1.2 文章结构文章分为五个部分进行介绍和讨论。
除引言外，还包括实验方法和观测技术、结果与讨论、结论与展望等部分。
在实验方法和观测技术部分中，我们将详细描述用于测量双光子吸收的实验装置以及样品的制备方法。
同时，还将介绍双光子吸收实验的步骤和原理，并探讨相关观测技术和数据分析方法的应用。
结果与讨论部分将呈现实验结果并进行详细的数据分析。
我们还将对这些结果进行解释和讨论，探究实验所得结论的意义和启示。
最后，在结论与展望部分，我们将总结本文研究内容及成果，并对未来研究方向进行展望和提出建议。
1.3 目的本文旨在全面介绍双光子吸收的近红外光，并深入探讨其在科学研究和应用领域中的潜力。
通过对实验方法、观测技术、实验结果以及结果意义等方面的描述和分析，读者可以获得关于双光子吸收近红外光的全面了解。
同时，为未来相关研究提供参考和展望。
2. 双光子吸收的近红外光解释说明：2.1 近红外光的定义与特性：近红外光是指波长介于700纳米到2500纳米之间的电磁波。
与可见光相比，近红外光具有较长的波长，能够穿透某些生物组织和其他材料。
这使得近红外光在生物医学、材料科学和化学等领域中得到广泛应用。
2.2 双光子吸收的基本原理：双光子吸收是指在近红外范围内，分子或材料同时吸收两个能量较低的光子而达到激发能级。
传统上，单一的高能量光量子可以激发物质中的一个电子，而双光子吸收则利用了两个低能量光量子相互作用以产生同样效果。
双光子技术的原理及应用
双光子技术的原理及应用前言双光子技术是一种基于量子力学原理的新型光学技术，它利用低能量、超快速的激光脉冲产生的双光子效应，实现了很多传统光学方法所无法实现的功能。
本文将介绍双光子技术的原理以及其在各个领域的应用。
原理双光子技术的原理基于量子力学的超快速过程，主要包括以下几个方面：1.双光子吸收：双光子吸收是指两个光子几乎同时被一个激发态的原子或分子吸收。
在传统的光学中，光子与物质的相互作用是单光子吸收，而双光子吸收则是两个光子几乎同时被物质吸收。
这种过程需要满足一定的能量和动量守恒关系。
2.被激辐射的双光子发射：双光子激发还可以引起双光子的辐射，这在传统的光学中是不可能实现的。
双光子辐射是指一个激发态的原子或分子在光子碰撞下同时发射两个光子。
3.非线性光学效应：双光子技术利用了非线性光学效应，而传统光学则是基于线性光学理论。
非线性光学效应是指光与物质相互作用时，光的输出与输入之间不是简单的比例关系。
通过调整光的强度、频率和相位等参数，可以实现一系列非线性效应，如频率倍增、非线性折射和光学相位共轭等。
应用双光子技术在各个领域都有广泛的应用，下面将分别介绍几个典型的应用场景。
生物医学1.双光子显微镜：双光子显微镜是一种高分辨率、无损伤的生物成像技术。
它利用双光子吸收效应，通过调控激光脉冲的强度和频率，可以实现对生物样品的深层次显微观察，对活体细胞、组织甚至整个小动物的三维结构和功能进行研究。
2.光合成研究：双光子技术可以应用于光合成研究中。
通过双光子激发，可以提供足够的能量给叶绿素分子，激发出叶绿素的激发态，从而研究光合作用的机制和动力学过程。
材料科学1.量子点材料：双光子技术可以用于研究和制备量子点材料。
通过调控激光脉冲的参数，可以实现对量子点的精确定位和操控，进而研究其光电性能和应用。
2.光学器件加工：双光子技术可以实现高分辨率的光学器件加工。
利用双光子吸收效应，可以在材料表面产生微细结构，如光子晶体、微透镜和微型通道等，用于光子学、光电子学和光学通信等领域。
基于高速相位型空间光调制器的双光子多焦点结构光显微技术
基于高速相位型空间光调制器的双光子多焦点结构光显微技术*喻欢欢 张晨爽 林丹樱 于斌† 屈军乐(深圳大学物理与光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060)(2020 年10 月29日收到; 2020 年11 月24日收到修改稿)多焦点结构光照明显微镜(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50 µm的成像深度内实现2倍于衍射极限分辨率的提升, 但在对厚样品成像时, 散射光和离焦光限制了其层析能力和图像衬度.双光子多焦点结构光照明显微镜(two-photon MSIM, 2P-MSIM)克服了样品组织散射的影响, 进一步提高了MSIM的成像深度和成像特性. 然而, 现有的2P-MSIM通常采用振镜扫描成像, 系统复杂, 灵活性差. 为了解决上述问题, 本文提出了一种基于高速相位型空间光调制器(spatial light modulator, SLM)的双光子多焦点结构光照明超分辨显微成像系统, 通过在SLM上同时加载生成多焦点阵列的相位图和线性相位光栅的相位图,实现了多焦点阵列的产生和在样品面上的高精度的并行数字随机寻址扫描和激发成像, 结合像素重定位和反卷积技术实现了三维双光子多焦点结构光超分辨成像, 解决了扫描振镜在2P-MSIM成像中的机械惯性问题,同时降低了系统的复杂性, 提升了灵活性. 在此基础上, 利用搭建的2P-MSIM开展了小鼠肾组织切片和铃兰根茎双光子超分辨成像实验, 验证了该方法的三维超分辨成像能力, 对于2P-MSIM的发展具有重要的意义.关键词：多焦点结构光照明显微技术, 双光子, 荧光显微镜, 空间光调制器PACS：87.64.M–, 87.64.kv, 42.30.–d, 87.85.Pq DOI: 10.7498/aps.70.202017971 引 言近年来, 多种突破光学衍射极限限制的超分辨显微技术蓬勃发展, 如: 受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED)显微技术[1]、光激活定位显微技术[2]、随机光学重构显微成像技术(stocha-stic optical reconstruction microscopy, STORM)[3]及结构光照明显微成像技术(structured illumina-tion microscopy, SIM)[4]等, 已达到了纳米量级的空间分辨率, 实现了对细胞内精细结构的观察, 极大地推动了生命科学等诸多领域的发展. 尽管STED显微技术能对较厚的生物组织进行高分辨率成像, 但需要特定荧光标记的样品及高能量的损耗光, 后者一定程度地造成了光漂白和光损伤, 限制了该技术的进一步应用. STORM虽能提供更高分辨率成像, 但其不仅仅受到荧光染料种类的限制, 宽场的激发方式和稀疏化的发光模式进一步限制了其成像深度和成像速度. 与此同时, SIM虽然仅仅能提供2倍的分辨率提升, 但由于其具有成像时不受荧光染料的限制, 不需要高的激发光功率, 以及快的成像速度等优势, 在活细胞成像方面获得广泛的应用. 令人遗憾的是, 传统的宽场结构光照明显微成像技术仅仅能实现对比较薄的样品(< 10 µm)超分辨成像, 限制了其发展. 图像扫描显微镜(image scanning microscopy, ISM)[5]被认* 国家自然科学基金 (批准号: 61975131, 61775144, 61835009)、广东省自然科学基金(批准号: 2018A030313362)、广东省高等学校科技创新(重点)项目(批准号: 2016KCXTD007)和深圳市基础研究项目(批准号: JCYJ20170818141701667, JCYJ201708资助的课题.† 通信作者. E-mail: yubin@© 2021 中国物理学会 Chinese Physical Society 为是一种点扫描照明显微成像技术, 这种超分辨技术的出现大大提高了结构光照明显微成像技术的成像深度. 然而, 单个聚焦点的扫描方式限制了ISM的成像速度, 于是多焦点结构光照明显微镜(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)[6]被提出, 采用多点并行扫描的方式, 大大提高了单点扫描结构光照明显微镜的成像速度.MSIM 不仅能够实现2倍于宽场显微镜的成像分辨率, 还具有传统共聚焦显微技术的层析能力, 成像深度可以达到50 µm. 但是, 在对厚样品成像时, 样品中的散射和离焦背景光降低了MSIM 的成像特性. 双光子显微镜由于成像深度大并具有较好的层析能力在生物成像领域获得了广泛应用.发展基于双光子技术的MSIM, 即双光子多焦点结构光照明显微镜(two-photon MSIM, 2P-MSIM),进一步提升MSIM的成像性能, 将进一步推进其在活体厚样品超分辨成像中广泛应用. MSIM采用数字微镜器件(digtital micromirror device, DMD)实现点阵的产生和扫描, 但是DMD因其较低的能量利用率而难以实现2P-MSIM. 为了能够获得高效的多焦点双光子激发, 各种不同类型的光学器件被应用在多光子多焦点显微成像技术中, 包括光分束器[7]、微透镜阵列[8−10]、衍射光学元件[11,12]及空间光调制器(spatial light modulator, SLM)[13−15]等. 目前, 在2P-MSIM[10]中, 主要采用微透镜阵列与扫描振镜相结合的方式实现双光子点阵的激发和扫描, 但其双光子激发点阵是固定的, 灵活性差.而基于SLM的多焦点产生技术在点阵的均匀性、效率及随机性方面都具有较大的优势. 利用SLM 生成点阵的算法主要有基于相位恢复(Gerchberg-Saxton, GS)算法[16]、广义自适应加法算法[17]、直接搜寻算法[18]、以及加权相位恢复(weighted GS, WGS)算法[19,20]等. 在这些算法中, WGS算法生成的点阵具有更好的均匀性和效率. 直到目前, 几乎所有的多焦点多光子结构光照明显微成像系统都需要振镜来实现扫描成像, 系统具有较大的复杂性且受机械惯性的影响, 灵活性差. 为了解决上述问题, 本文提出并搭建了一种基于高速相位型SLM的2P-MSIM, 仅通过在SLM上加载生成点阵和线性相位光栅的合成相位图, 就同时实现了点阵产生和在样品面上高精度并行数字随机寻址扫描激发, 结合像素重定位和反卷积技术实现了三维双光子多焦点结构光超分辨成像. 利用搭建的系统完成了对小鼠肾切片、铃兰根茎及荧光珠的双光子超分辨成像, 具有较好的成像效果, 验证了该方法的三维超分辨成像能力.2 2P-MSIM原理与方法2.1 2P-MSIM成像理论2P-MSIM被认为是一种并行的2P-ISM, 其实现超分辨的原理与2P-ISM一致. 在ISM[5]中,一个面阵探测器替换了激光共聚焦扫描显微镜中的点探测器. 探测器探测到的图像不仅仅与激发点的位置有关, 同时也与探测器上的像素点的位置有关, 因此, 在不考虑系统放大倍率的情况下, 在样品面扫描位置r处, 探测器s位置处的双光子荧光光强分布可以表示为[5,21]c(r′)E(r′)U(r+s)E0(r)U(r+s)E0(r)=E2(r)σinσdet其中, 表示荧光分子分布, 表示在扫描位置为r的系统激发点扩散函数, 表示探测位置为r + s的系统探测点扩散函数. 那么, 在双光子激发下, 系统有效的点扩散函数可表示为, 其中, 表示在扫描位置为r的双光子激发点扩散函数. 假设双光子激发点扩散函数和系统探测点扩散函数采用高斯分布模型, 且标准差分别为和, 那么双光子激发下, 系统有效的点扩散函数可重新表示为[22]U eff其中, G表示高斯函数, 表示有效的点扩散函数.σ2P-in=σex/√2σexλexλdet1<k<2k=λex/λdetσex=kσdetσ2P-in=kσdet/√2在2P-ISM中, 双光子激发点扩散函数为系统激发点扩散函数的平方, 则双光子激发点扩散函数的标准差为, 其中为单光子激发下, 系统激发点扩散函数的标准差. 在双光子激发过程中, 分子吸收两个光子经过斯托克斯位移后自发辐射出单个光子, 则双光子激发波长与探测波长的比值, 其中. 所以系统激发点扩散函数和系统探测点扩散的标准差之间的关系变为, 因此, 双光子激发点扩散函数的标准差与系统探测点扩散函数标准差之间关系为.假设不考虑双光子激发时荧光染料的吸收截面, 再结合(2)式, 则2P-ISM的有效点扩散函数U 2P-eff 可以描述为I r −k 2k 2+2s ,s 因此, 有效的双光子图像可以通过 对s 的积分来重构:再结合(1)式, 2P-MSIM 有效图像可重新表示为如果从频率域来考虑, 那么两边同时进行傅里叶变换将得到:(k 2+2)/k 2(k 2+2)/k 2从(6)式可以看出, 有效图像包含的频谱范围是宽场照明得到 , 所以, 通过像素重定位(pixel reassignment)和反卷积(deconvolution)处理, 理论上2P-MSIM 相比于宽场显微镜能实现倍分辨率的提升.2.2 系统光路设计2P-MSIM 是基于尼康显微镜实现的(Nikon ECLIPSE Ti-U). 一台波长为1036 nm 、功率为1 W 、脉宽为145 fs 的激光从光纤激光器发出(安扬, FemotoYL-6), 首先通过一个可用来调节激光出射功率的半波片(Thorlabs, AHWP05M-980)和偏振分光棱镜对; 从偏振分光棱镜出射的P 偏振光再次经过半波片(Thorlabs, AQWP10M-980),用来调整飞秒光在通过SLM 之前的偏振方向. 然后, 光束被一对包含焦距为25 mm (Thorlabs,AC127-025-B-ML)以及焦距为80 mm (Thorlabs,AC254-080-B-ML)的透镜对扩束; 经扩束后的光束通过一个可调光阑照射在一个高速相位型SLM (Meadowlark Optics, 像元数为1920 × 1152, 像素尺寸为9.2 µm × 9.2 µm)上; 通过在SLM 上加载生成点阵和线性相位光栅的合成相位图, 能够实现多个聚焦点阵列在其傅里叶面上的扫描移动;经SLM 调制的激发光经过一个焦距为300 mm 的透镜(Thorlabs, AC508-300-B)后照射在显微镜的管镜上; 为了满足SLM 采光面大小与物镜后孔径面大小尽可能匹配, 将原来的管镜替换成焦距为300 mm, 尺寸为2英寸的透镜(Thorlabs, A508-300-AB-ML), 与前一个透镜构成一个无扩束的4f 系统;为了只让SLM 的一级光通过系统, 在4f 系统两个透镜间放置一个可调光阑用来滤除SLM 的其他衍射级的光; 光束经过管镜后又经过水浸物镜(Nikon, 60 ×, NA 为1.27)在样品面上形成多个聚焦点; 样品被激发后产生的荧光信号经二向色镜与发射片后由sCMOS 相机(滨松,ORCA-Flash4.0 v3)接收. 整个光路的示意图如图1所示.SLMSampleLaser λ/2 plate λ/2 plate PBS f = 25 mmf = 300 mmf = 300 mmf = 80 mmMirrorMirror IrisDichroic mirrorObjectivesCMOS Tube lens f = 200 mm图 1 2P-MSIM 系统光路示意图Fig. 1. Schematic diagram of 2P-MSIM system.2.3 点阵产生和扫描相位图设计2.3.1 点阵相位图设计原理整个相位图的设计分成3步: 1)点阵相位图的设计; 2)用于点阵扫描的线性相位光栅的设计;3)将两个相位图进行叠加生成最终的复合相位图.√I (x )Φi (x )点阵相位图的生成方法采用的是一种改进的WGS 算法[20], 即当WGS 算法迭代几次后, 一直保持频谱面的相位不变, 用作下一次的迭代, 直至算法收敛. 利用这种方式大大减少了迭代次数, 加快了收敛速度. 在传统的WGS 算法中, 初值相位可以设置成分布范围为–π—π的随机矩阵, 当算法执行第i 次迭代时, 傅里叶平面的振幅和相位可以根据输入平面的振幅 和相位 经过二维Ψi (u )B i (u )Γ(u )g i (u )g i (u )傅里叶变换得到. 保持傅里叶面的相位 不变,振幅 用目标振幅 乘以一个不均匀性矫正的加权系数 来替换. 可以表达为⟨B i (u )⟩M δ(u )g 0(u )其中, 表示计算得到的M 个点的振幅平均值, 表示的是狄拉克函数, 设置为1.A i +1(x )Φi +1(x )√I (x )A i +1(x )g i (u )δΨi (u )δg i (u )g i (u )δΨi (u )Ψi (u )=ΨN (u )然后, 用替换后的振幅和计算得到的相位进行二维逆傅里叶变换就得到输入平面的振幅 和相位 , 通过这种方式不断迭代下去, 最后就能得到均匀性好的点阵的输入相位. 但是当用传统的WGS 算法生成点阵时, 我们发现在迭代过程中用 替换 使 在矫正均匀性时很难有较大的改善, 往往需要较长的时间才能实现较好的矫正效果. 主要原因是对于输入平面的傅里叶变换, 振幅的替换引入了一个相位改变量, 这个改变量要比加权系数改变量 大得多, 所以导致了 在矫正不均匀性方面很难有比较好的效果. 值得注意的是, 通过对后续的i +1次迭代的相位改变施加影响, 能有效地移除相位改变量 . 具体做法是在WGS 算法执行N 次迭代达到目标调制效率后, 保持后续迭代中傅里叶平面的相位不变, 即. 利用这种方法, 算法可以在很少的迭代次数就完成了收敛, 且最终生成了一个均匀性好、效率高的多焦点阵列. 算法的执行过程可以通过图2(a)来表示,图2(b)和图2(c)分别表示利用该算法得到的相位图和点阵图.2.3.2 线性相位光栅的设计线性相位光栅的相位表达式可以表示为其中, k 表示光栅的频率, r 表示SLM 面的坐标.exp (i 2πkr )δ(u −k )δ(ufλ−k )k =ρfλδ(u −ρfλ)B i (u )Ψi (u )B i(u −ρfλ)Ψi(u −ρfλ)相应地, 复振幅表达式可以写成 ,从频率空间来考虑, 其傅里叶变换为 . 考虑到光学的傅里叶变换和数学上傅里叶变换的坐标变换关系, 相位光栅对应的傅里叶面的复振幅分布为 , 其中f 表示透镜的焦距, l 表示激光器的波长. 再令 , 则该复振幅表达式变为 . 假设生成的点阵对应的复振幅为且激光器的波长带宽很窄, 考虑到空域内的复振幅的乘积对应频域内的复振幅的卷积, 则相应的叠加相位图对应傅里叶面的复振幅分布为. 从这个表达式上看, 点阵的位置被移动了r .δf /k max δf =fλ/D k max jδf δf k max 由于SLM 本身是由一个个的像素单元构成的, 在SLM 面上的相位光栅的相位值被离散化,所以实际的线性相位光栅不可能实现点阵的连续移动. 根据文献[23], 相位光栅能实现的扫描精度为 , 这里, D 表示物镜的通光孔径; 表示相位光栅产生位移在 — 的最大可实现个数, 可以表示为其中, N 为产生的相位光栅在SLM 上所占的像素个数, g 为是SLM 的灰度级. 综合以上的分析, 利用线性相位光栅可实现亚纳米级的扫描步长.根据以上的相位图的设计理论, 利用MATLAB 软件分别生成点阵的相位图和线性相位光栅的相位图, 最后通过相位叠加的方式生成最后的相位图.FTIFT[Focal plane](a)(b)(c)( ), ( )( ), ( ) ( ) ( ), ( )[SLM plane]( )( ) ( )= ( )if > , ( )= ( )图 2 (a) WGS 算法流程图; (b)得到的相位图; (c)生成的点阵图Fig. 2. (a) Flow chart of WGS algorithm; (b) generated phase map; (c) generated multi-focus array.2.4 2 P-MSIM 数据获取与分析为了实现同步扫描同步记录的目的, 用LABV-IEW 软件分别控制纳米位移台(Pi, E-709)、相机和空间光调制器. 实验中, 纳米位移台每上升一步,就用SLM 和相机完成一层的成像. SLM 每加载一张图片, 相机同时曝光记录一次, 直至成像完成整个二维平面. 根据每一层的图像信息能够完成对荧光样品的三维重构.与单光子的MSIM 的数据处理方法[6]相类似,2P-MSIM 超分辨图像也可以通过像素重定位技术, 即: 多焦激发(multifocal-exciting)、数字高斯针孔(pinholing)滤波、图像缩放(scaling)、求和(summing) 4个图像处理步骤来重建超分辨图像(multifocal-exciting pinholing scaling summing,MPSS), 再经过Richardson-Lucy (RL)反卷积来进一步提升图像的分辨率, 获得2倍分辨率提升的2P-MSIM 图像. 考虑到激发点大小的改变和波长的差异, 实际的处理过程需要对实验室已有程序[24]略微加以改进, 即可获得近似2倍分辨率提升的双光子超分辨图像.3 结果与讨论3.1 荧光珠成像为了测试系统的空间分辨率, 首先对尺寸100 nm, 中心发射波长为580 nm 的荧光珠进行成像, 由于所选荧光珠尺寸小于该成像系统的理论分辨率, 所以实验分析时未考虑荧光珠直径对测量的半高全宽的影响. 对得到的2P-MSIM 原始数据进行了重构, 分别获得了点阵激发图通过添加高斯数字针孔再叠加(pinholed+summed)的初步降噪的宽场图像(pinholed widefield, Pinholed WF)、像素重定位的MPSS 图像及MSIM 图像, 结果如图3所示. 图3(a)—(c)分别表示荧光珠在经过这3个过程后得到的图像, 大的虚线框内的荧光珠为小的虚线框内的荧光珠的放大, 可以明显观察到在PinholedWF 图像中原本分不开的荧光珠图像在MPSS 和MSIM 图像中能明显地分开. 图3(d)为图3(a)—(c)中黄色实线所在像素的值的大小与对应的像素所占的宽度作的曲线拟合, 每条曲线都经过了归一化处理. 为了能标定系统的分辨率,1.00.80.6N o r m a l i z e d i n t e n s i t yWidth/m m0.40.2000.20.40.60.8 1.0 1.2PinholedWF MPSS MSIM1.00.80.6N o r m a l i z e d i n t e n s i t yWidth/m m 0.40.200.20.40.60.8 1.0PinholedWF MPSS MSIMPinholedWF (a) 2 m m (b) 2 m m(c)2 m m(d)(e)图 3 100 nm 荧光珠成像 (a) PinholedWF 图像; (b) MPSS 图像; (c) MSIM 图像; (d)图(a)—(c)中黄色实线所在像素值的大小与对应像素所占宽度的拟合曲线; (e)单个荧光珠的高斯拟合曲线Fig. 3. 100 nm fluorescent bead imaging: (a) PinholedWF image; (b) MPSS image; (c) MSIM image; (d) fitting curves of the size of the pixel value of the yellow solid lines in panel (a)－(c) vs. the width of corresponding pixel; (e) Gaussian fitting curves of a single fluorescent bead.也对视场范围内10颗荧光珠的图像进行高斯曲线拟合, 并进行统计平均, 得到了系统的平均分辨率,如图3(e)所示. 经过对单个荧光珠的Pinholed-WF, MPSS和MSIM图像拟合, 得到荧光珠的半高全宽值分别是(360 ± 15) nm, (207 ± 15) nm 和(148 ± 13) nm, 与系统的宽场分辨率相比基本实现了近似2倍的分辨率提升.3.2 小鼠肾切片三维成像2P-MSIM相比于1P-MSIM在成像深度方面有明显的提升, 具有良好的三维层析成像能力. 为了测试2P-MSIM的三维成像能力, 对商用的小鼠肾切片进行成像. 为了尽可能提高成像速度, 同时保证超分辨成像质量, 避免图像出现伪影及点阵信号之间的串扰. 设置点阵间隔为3250 nm, 点阵数量为8 × 8, 横向的扫描步长为130 nm, 整幅图像的成像时间是6.25 s, 成像区域大小为26.1 µm ×26.1 µm. 通过控制纳米位移台, 实现了同一个小鼠肾切片的不同厚度的成像, 分别是0, 5, 10 µm,如图4所示. 可以明显地观察到小鼠肾切片在不同深度结构的改变, 同时MSIM处理后的图像的分辨率具有显著的提高.为了能更直观地观察生物样品的三维结构, 进一步扫描了小鼠肾切片的一个三维成像区域, 横向的扫描参数设置保持不变, 轴向的扫描步长设置为200 nm, 扫描层数为30层, 这样总的成像深度为6 µm. 对每层进行超分辨处理后的数据通过Imaris软件进行三维堆栈. 如图5所示, 重构出的三维超分辨小鼠肾切片图像实现了近似2倍的分辨率提升.4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m图 4 小鼠肾切片的不同厚度层成像图Fig. 4. Images of different thickness layers of mouse kidney section.3.3 铃兰根茎成像为了进一步测试2P-MISM的成像能力和分辨率, 对铃兰根茎进行了成像. 和前文描述的方法一样, 对铃兰根茎的不同深度的区域完成了成像,成像深度分别是0, 12, 24 µm, 如图6所示. 可以看出原本无法观测到的铃兰根茎内部结构变化在超分辨处理后能较清晰地观测到, 进一步验证了所搭建2P-MSIM的成像能力.4 结 论本文提出和搭建了一套新的双光子多焦点结构光超分辨显微成像系统. 利用了一个高速相位型空间光调制器同时完成了多焦点阵列的生成及点阵在样品面上的高精度扫描移动, 实现了双光子多焦点成像的目的, 解决了扫描振镜在多焦点成像中的机械惯性问题, 同时降低了系统的复杂性, 提高8 m m8 m m图 5 小鼠肾切片三维成像图 (a) PinholedWF图像; (b) MSIM图像Fig. 5. Three-dimensional image of mouse kidney section: (a) PinholedWF image; (b) MSIM image.4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m图 6 铃兰根茎不同厚度层成像图Fig. 6. Images of different thickness layers of lily of the valley rhizome.了灵活性. 另外, 为了进一步提高双光子多焦点成像的分辨率, 把点扫描结构光成像和双光子成像结合在一起, 实现了双光子多焦点结构光照明的超分辨成像, 将双光子多焦点的成像分辨率提高了近2倍. 最后, 利用该系统完成了小鼠肾切片和铃兰根茎的三维超分辨成像, 证实了该系统具有优异的成像特性, 为进一步开展活体细胞及组织的超分辨成像打下了基础.参考文献H ell S W, Wichmann J 1994 Opt. Lett. 19 780[1]B etzig E, Patterson G H, Sougrat R, Lindwasser O W,Olenych S, Bonifacino J S, Davidson M W, Lippincott-Schwartz J, Hess H F 2006 Science 313 1642[2]R ust M J, Bates M, Zhuang X W 2006 Nat. Methods 3 793[3]G ustafsson M G L 2000 J. Microsc. 198 82[4]M uller C B, Enderlein J 2010 Phys. Rev. Lett. 104[5]Y ork A G, Parekh S H, Nogare D D, Fischer R S, Temprine K, Mione M, Chitnis A B, Combs C A, Shroff H 2012 Nat.Methods 9 749[6]N ielsen T, Frick M, Hellweg D, Andresen P 2001 J. Microsc-Oxford 201 368[7]B ewersdorf J, Pick R, Hell S W 1998 Opt. Lett. 23 655[8]Q u J L, Liu L X, Chen D N, Lin Z Y, Xu G X, Guo B P, Niu [9]H B 2006 Opt. Lett. 31 368I ngaramo M, York A G, Wawrzusin P, Milberg O, Hong A,Weigert R, Shroff H, Patterson G H 2014 Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 111 5254[10]S acconi L, Froner E, Antolini R, Taghizadeh M R, Choudhury A, Pavone F S 2003 Opt. Lett. 28 1918[11]J ureller J E, Kim H Y, Scherer N F 2006 Opt. Express 14 3406[12]S hao Y, Qin W, Liu H, Qu J, Peng X, Niu H, Gao B Z 2012 Appl. Phys. B 107 653[13]M atsumoto N, Okazaki S, Fukushi Y, Takamoto H, Inoue T, Terakawa S 2014 Opt. Express 22 633[14]M atsumoto N, Konno A, Ohbayashi Y, Inoue T, Matsumoto A, Uchimura K, Kadomatsu K, Okazaki S 2017 Opt. Express25 7055[15]S inclair G, Leach J, Jordan P, Gibson G, Yao E, Laczik Z J, Padgett M J, Courtial J 2004 Opt. Express 12 1665[16]C urtis J E, Koss B A, GrierD G 2002 Opt. Commun. 207 169[17]M eister M, Winfield R J 2002 Opt. Commun. 203 39[18]D i Leonardo R, Ianni F, Ruocco G 2007 Opt. Express 15 1913[19]K im D, Keesling A, Omran A, Levine H, Bernien H, Greiner M, Lukin M D, Englund D R 2019 Opt. Lett. 44 3178[20]S heppard C J R, Gu M 1990 Opitk 86 104[21]R oider C, Heintzmann R, Piestun R, Jesacher A 2016 Opt.Express 24 15456[22]S chmitz C H J, Spatz J P, Curtis J E 2005 Opt. Express 13 8678[23]L i S W, Wu J J, Li H, Lin D Y, Yu B, Qu J L 2018 Opt.Express 26 23585[24]Two-photon multifocal structured light microscopy based on high-speed phase-type spatial light modulator*Yu Huan -Huan Zhang Chen -Shuang Lin Dan -Ying Yu Bin † Qu Jun -Le(Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, College of Physics andOptoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)( Received 29 October 2020; revised manuscript received 24 November 2020 )AbstractMultifocal structured illumination microscopy (MSIM) can achieve a doubled improvement in the resolution of the diffraction limit within an imaging depth of 50 µm. But when imaging thick samples, scattered light and defocused light limit its optical sectioning capability and image contrast. Two-photon MSIM (2P-MSIM) overcomes the influence of sample tissue scattering and further improves the imaging depth and imaging characteristics. However, the existing 2P-MSIM usually adopts galvanometer based scanning mirrors for precisely scanning imaging, which is a complicated and poor flexibility system. Here we propose a simpler 2P-MSIM. Two-photon multifocal scanning imaging can be realized by a spatial light modulator (SLM) with a high frame rate (< 845 Hz). The phase map of generating multi-focus array and linear phase grating loaded on the SLM simultaneously, high-precision parallel digital random address scanning and excitation imaging on the sample surface can be realized. The mechanical inertia problem of the galvanometer scanner in multifocal imaging can be solved by the proposed method while reducing the complexity of the system and improving flexibility. We finally realize two-photon multifocal imaging of mouse kidney tissue slices and lily of the valley rhizome by this system, which verifies the three-dimensional super-resolution imaging capability of this method. It is of great significance in developing the 2P-MSIM.Keywords: multifocal structured illumination microscopy, two-photon, fluorescence microscope, spatial light modulatorPACS: 87.64.M–, 87.64.kv, 42.30.–d, 87.85.Pq DOI: 10.7498/aps.70.20201797* Project supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 61975131, 61775144, 61835009), the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Grant No. 2018A030313362), the Scientific and Technological Innovation (Key) Projects of Department of Education of Guangdong Province, China (Grant No. 2016KCXTD007), and the Shenzhen Basic Research Project, China (Grant Nos. JCYJ20170818141701667, JCYJ20170818144012025, JCYJ20170412 105003520, JCYJ20180305125649693).† Corresponding author. E-mail: yubin@。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
双光子显微镜原理
双光子显微镜原理
双光子显微镜是一种先进的显微镜技术，利用双光子激发来实现高分辨率的三维成像。
双光子显微镜原理的核心在于利用两个光子同时激发样本中的荧光分子，从而实现对样本的高分辨率成像。
在传统的荧光显微镜中，通常使用单光子激发样本中的荧光分子，但是由于单光子的激发会导致样本的非特异性激发，从而降低了成像的分辨率。
而双光子显微镜利用两个光子同时激发样本中的荧光分子，只有在两个光子同时到达时才会发生激发，因此可以实现更高的空间分辨率。
双光子显微镜原理的关键在于双光子的激发机制。
在双光子显微镜中，两个光子的能量之和等于被激发的荧光分子的激发能级，当两个光子同时到达时，才能使荧光分子跃迁到激发态，从而产生荧光信号。
由于双光子的激发需要两个光子同时到达，因此只有在聚焦点附近才会发生激发，从而实现了更高的空间分辨率。
双光子显微镜原理的另一个重要特点是深度成像能力。
由于双光子的激发是非线性的过程，只有在聚焦点附近才会发生激发，因此双光子显微镜可以实现深度成像，即在样本内部进行高分辨率的三维成像。
这使得双光子显微镜在生物医学领域的应用具有重要意义，可以实现对生物样本内部结构的高分辨率成像。
总的来说，双光子显微镜原理利用双光子激发实现了高分辨率的三
维成像，具有高空间分辨率和深度成像能力。
这种先进的显微镜技术在生物医学领域有着广泛的应用前景，可以帮助科研人员更好地理解生物样本的内部结构，并促进生物医学研究的发展。
新型双光子显微成像系统生物医学应用探索
新型双光子显微成像系统生物医学应用探索一、新型双光子显微成像系统概述新型双光子显微成像技术是一种先进的生物医学成像技术，它利用双光子吸收过程来激发荧光，从而实现对生物样本的深层成像。
与传统的单光子成像技术相比，双光子显微成像技术具有更高的成像深度和更好的空间分辨率，这对于生物医学研究具有重要的意义。
1.1 新型双光子显微成像技术原理双光子显微成像技术基于双光子吸收现象，即一个荧光分子同时吸收两个低能量的光子，从而被激发到高能级状态。
这种现象通常发生在高斯激光束的焦点处，因此可以实现对生物样本的深层成像，同时减少光毒性和光漂白现象。
1.2 新型双光子显微成像技术的优势新型双光子显微成像技术具有以下优势：- 高成像深度：能够穿透生物样本数百微米，远超传统单光子成像技术。
- 高空间分辨率：由于双光子吸收过程的非线性特性，可以实现亚微米级别的空间分辨率。
- 减少光毒性：由于激发光的波长较长，对生物样本的光毒性较小。
- 减少光漂白：双光子吸收过程的非线性特性使得荧光分子的激发效率较低，从而减少光漂白现象。
1.3 新型双光子显微成像技术的应用领域新型双光子显微成像技术在生物医学领域有着广泛的应用，包括但不限于：- 神经科学研究：用于观察活体动物大脑中的神经网络活动。
- 细胞生物学研究：用于研究细胞内部结构和动态过程。
- 发育生物学研究：用于观察胚胎发育过程中的细胞迁移和分化。
- 病理学研究：用于研究疾病状态下的组织结构变化。
二、新型双光子显微成像系统的构建新型双光子显微成像系统的构建是一个复杂的过程，涉及到光学系统、电子系统、计算机系统等多个方面的设计和集成。
2.1 光学系统的构建光学系统是新型双光子显微成像系统的核心部分，包括激光器、扫描系统、物镜、检测系统等。
激光器提供双光子吸收所需的高能量光子，扫描系统控制激光束在样本上的扫描，物镜聚焦激光束并收集荧光信号，检测系统检测并转换荧光信号为电信号。
2.2 电子系统的构建电子系统负责控制光学系统的运行，并处理检测系统收集到的电信号。
双光子成像原理范文
双光子成像原理范文双光子成像是一种高分辨率、非线性光学成像技术，它利用了双光子吸收过程中的非线性效应。
相比传统的单光子成像技术，双光子成像具有更高的光学穿透深度、更小的背景噪声和更少的光损伤，因此在生物医学研究领域具有重要的应用价值。
双光子成像基于双光子吸收的原理。
在常规的线性光学成像过程中，物质吸收光子的能量是与光子的能量成正比的，而在双光子吸收过程中，物质吸收两个光子的总能量，其能量与两个光子的能量之积成正比。
因此，双光子成像需要使用高能量的飞秒激光作为光源，并且需要将样品聚焦到激光束的焦斑处。
在双光子成像中，激光束通过透镜系统聚焦到样品上，由于激光束的强度分布呈高斯型，聚焦区域较小，因此可以减小背景信号的干扰。
当样品中存在有荧光染料或其他非线性材料时，当两个飞秒激光束几乎同一时间到达样品，并且在聚焦区域内交叉，染料分子可以吸收两个光子的能量，被激发到高能级。
在激发态经历一个跃迁过程后，染料分子会发出较长波长的荧光信号。
这种荧光信号会通过同一透镜系统聚焦到探测器上，通过记录和解析荧光信号的空间位置和强度，就可以获得样品的三维信息。
与传统的单光子成像相比，双光子成像具有以下几个优势。
首先，由于飞秒激光的高光强度和高能量，双光子成像可以实现更高的光学穿透深度。
这使得双光子成像可以用于观测高度组织化的样品，比如脑组织、淋巴结、肝脏等，而传统的单光子成像技术则很难实现。
此外，双光子成像由于激光束的聚焦性，可以减小背景信号的干扰，并减少样品累积光损伤的可能性。
最后，双光子成像的分辨率可以达到亚细胞水平，可以观测到更小的细胞结构和分子动力学行为。
双光子成像技术已经在生物医学研究领域得到了广泛的应用。
它可以用于观测神经元连续活动的研究、血管形态学分析、脑血流动力学研究、皮肤病诊断等。
此外，由于双光子成像可以对样品进行三维成像，因此还可以用于构建多维图像、生成体细胞分布图和跟踪标记物质的空间位置等。
值得一提的是，双光子成像技术仍然存在一些挑战和局限性。
双光子共焦显微镜的工作原理
双光子共焦显微镜的工作原理双光子共焦显微镜（Two-Photon Confocal Microscope, 2P-CM）是一种高分辨率的显微镜技术，通过使用非线性光学效应来实现对生物样品的成像。
与传统的单光子荧光显微镜相比，双光子共焦显微镜具有更好的光深穿透能力和较低的光损伤性，因此被广泛应用于生命科学研究领域。
1. 双光子共焦显微镜的基本原理1.1 光的双光子吸收双光子共焦显微镜利用注入样品的高能量激光束，通过非线性吸收效应实现成像。
在常规显微镜中，荧光分子被激发到高能级，然后辐射出较低能级的光子。
而双光子共焦显微镜中，两个低能量光子同时作用于样品的一个分子上，通过吸收两个光子的能量，荧光分子才会被激发。
这种吸收方式只发生在激光束的焦点附近。
1.2 双光子激发荧光在双光子共焦显微镜中，激发的荧光只发生在光束焦点的非线性光学效应区域内。
由于双光子激发荧光只发生在焦点处，因此可以避免样品其他区域的荧光信号干扰。
这样，双光子共焦显微镜可以实现更好的光深穿透能力，同时减少了样品的光损伤。
2. 双光子共焦显微镜的工作步骤2.1 激光光源双光子共焦显微镜使用超快激光作为光源。
这些激光器产生具有较高光能量和较窄脉冲宽度的激光束。
常用的激光器包括钛宝石激光器和光纤激光器。
2.2 光路系统双光子共焦显微镜的光路系统主要包括准直系统、物镜、光学滤波器和探测器。
准直系统通过聚焦激光束，将其聚焦到样品的焦点位置。
物镜收集经过样品的荧光信号，并将其聚焦到探测器上。
光学滤波器用于选择特定的波长范围，以增强成像质量。
2.3 数据采集和成像双光子共焦显微镜通过扫描激光束和收集荧光信号来获取图像。
通常，激光束在样品上进行快速扫描，而探测器记录下相应的荧光信号。
通过逐点记录和成像，可以获得三维样品信息。
3. 双光子共焦显微镜的应用3.1 三维成像双光子共焦显微镜具有较好的光深穿透能力，在生命科学研究中被广泛用于三维细胞和组织成像。
双光子共聚焦显微镜的原理
双光子共聚焦显微镜的原理
双光子共聚焦显微镜是一种高分辨率成像的显微镜技术，它利用激光脉冲的双光子效应实现成像。
具体来说，该技术利用两个低能量的激光束在样品中交叉聚焦，使得只有在激光束交叉区域内才会发生双光子吸收，从而激发样品的荧光。
随着扫描平台的移动，整个样品表面都会被扫描到，从而实现高分辨率的三维成像。
该技术具有比传统荧光显微镜更高的分辨率，能够观察到更小的细胞结构和分子级别的细节。
同时，双光子共聚焦显微镜还具有较低的光毒性和光伤害，适用于活体样品的成像。
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双光子激发荧光显微镜的操作指南
双光子激发荧光显微镜的操作指南引言：双光子激发荧光显微镜是一种先进的显微镜技术，可以在深部组织中实现高分辨率的成像。
本文将介绍双光子激发荧光显微镜的基本原理，以及如何正确操作该设备。
一、双光子激发荧光显微镜的基本原理双光子激发荧光显微镜利用两个红外光子通过非线性光学效应来激发样品中的荧光分子。
相比传统显微镜技术，它具有更大的穿透深度和更低的光伤害。
在进行操作前，我们需要了解设备的组成和原理。
1. 激光系统双光子激发荧光显微镜主要由激光系统、扫描器和探测器组成。
激光系统提供激发光源，通常采用飞秒激光器。
激光器的功率和波长需要根据不同实验需求进行调整。
2. 扫描器扫描器是用于控制光束在样品上的移动和聚焦的设备。
它由一个可调节的镜头和一个透镜组成。
通过调整扫描器的焦距和聚焦位置，可以实现高分辨率的成像。
3. 探测器探测器用于接收和记录荧光信号。
常见的探测器有光电倍增管（PMT）和光电二极管（APD）。
选择合适的探测器可以提高信噪比和灵敏度。
二、操作步骤正确使用双光子激发荧光显微镜需要遵循一系列操作步骤，以确保高质量的成像结果。
1. 样品制备首先，我们需要准备好待观察的样品。
样品必须具有较好的透明性，且荧光染料能与激发光相互作用。
在准备过程中，应注意保持样品的湿润和防止氧化。
2. 设定激发光源根据样品和实验需求，设定合适的激发光功率和波长。
过高的激发功率可能导致样品烧伤，而不足的激发功率可能无法产生荧光信号。
此外，还需注意避免激光直接照射眼睛，应佩戴适当的防护眼镜。
3. 调整扫描参数通过调整扫描器的位置和焦距，找到最佳成像条件。
在调整过程中，应注意避免扫描器和样品之间的碰撞，以防损坏设备或样品。
4. 选择合适的探测器根据实验需求和样品特性，选择合适的探测器。
PMT适用于强信号和较大的动态范围，而APD则具有高灵敏度和快速响应的特点。
5. 开始成像确定好各项参数后，可以开始进行成像。
在成像过程中，需要保持样品的稳定和定位准确，以避免图像模糊和偏移。
双光子荧光
双光子共焦激光扫描荧光显微镜的应用
application
钙离子通道的观察--贝尔 实验室研究了活体大脑皮 层神经元细胞内的钙离子 动力学情形. 对活老鼠大 脑作标记后,拨弄老鼠的 胡须以产生刺激,观察到 发生在大脑细胞神经元间 突触的活动,成像深度可 深达大脑240μm。
三维高密度存储及微 细加工--由于双光子激 发具有有效作用体积 小的特点,避免了层与 层间的相互干扰,极大 地提高了数据存储密 度.
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3 双光子荧光的特点及优点
3.1 特点：
(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区 (≥800nm)； (2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是 一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；
一成功用于双光子显微镜的双光子探针。
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双光子荧光探针的研究领域
双光子葡萄糖示踪器
具有良好的光稳定性，能够持 续监控正常细胞与结肠癌细胞摄入葡萄糖的过程，能够成 像观察癌细胞与结肠癌深处抗癌剂的能力，为癌症的早期 诊断提供帮助 双光子巯基探针 根据探针与巯基反应后荧光增强， 可用双光子显微镜探测活体细胞与组织90-180μ m深处的 巯基成像情况 双光子半胱氨酸探针 根据醛基（sp2）与半胱氨酸 反应后转变为叔甲基(sp3)而丧失吸电子效应这一原理实现
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
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双光子显微镜
Confocal
n
白炽灯的原理
电子吸收能量跃迁到高能级
高能级不稳定
高能级电子回到基态，发出光子
单光子吸收与荧光显微镜
荧光分子吸收一个光子跃迁 到高能级
高能级电子回到基态，发出
荧光
多光子效应
高能量的激发光照射荧光分子，荧光分
子短时间内吸收两个光子跃迁到高能级 高能级电子回到基态，发出荧光
提高信噪比
多光子显微镜研究—自适应校正
减少组织散射的影响 提高分辨率
多光子显微镜研究—三光子
多光子显微镜研究—微型化
北京大学程和平院士团队
结论
优势：
大深度（800um） 分辨率比宽场高 微型化、同时刺激和成像等的开发 劣势： 价格昂贵 分辨率比共聚焦低
多光子显微镜
双光子显微镜（Leica）
多光子显微镜优势—高分辨率
双光子显微镜
双光子效应是低概率事件，需要很高的激光
能量，因此只有焦点处会发生 需要采用高能量、短脉冲（防止样品发热、 提高信噪比）的飞秒激光器
宽场显微镜
多光子显微镜优势—高分辨率
未发生双光子效应的区域，不会激发荧光
多光子显微镜优势—大深度
双光子显微镜穿透深度深与双光子 效应无关，而是因为双光子显微镜采 用的是长波长（红外）的激光 因此，三光子激光器的波长更长， 穿透深度更深
多光子显微镜优势—大深度
选择波长应处于组织吸收较少的窗口，一般选择 700-900nm之间
多光子显微镜优势—伪彩色
多波长荧光的叠加
多光子显微镜研究—脉冲压缩
空间双光子态振幅和相位的观测成像
空间双光子态振幅和相位的观测成像
空间双光子态是一种特殊的量子态，由两个光子同时存在于空间中的状态。
观测空间双光子态的振幅和相位通常需要使用特殊的光学实验技术。
一种常用的方法是使用光子计数器和干涉仪的组合。
首先，在实验中产生空间双光子态，可以通过非线性光学效应（如自发参量下转换）或者双光子干涉的方式实现。
然后，将光子计数器放置在被测的空间中，记录通过该位置的光子个数。
通过多次测量并统计结果，可以获得光子的振幅信息。
为了观测相位信息，可以使用干涉仪。
干涉仪可以将来自不同路径的光线进行干涉，从而测量它们之间的相位差。
将空间双光子态分成两个路径，通过干涉仪，观察干涉图案的变化，可以得到光子的相位信息。
总结起来，观测空间双光子态的振幅和相位需要使用特殊的光学实验技术，如光子计数器和干涉仪的组合。
通过测量光子的个数和干涉图案的变化，可以获得振幅和相位信息。