环境内分泌干扰化学物的甄别方法和评价体系

・述评・

作者单位:610041成都,四川大学华西公共卫生学院环境卫生、营养与食品卫生教研室

环境内分泌干扰化学物的甄别方法和评价体系

张立实　吴德生

环境内分泌干扰化学物(environmental endocrine disrupting chemicals ,EEDCs )对人类和野生动物健康的危害已是不争的事实。从预防医学的观点出发,对环境中各种化学物的内分泌干扰活性进行甄别(screening and testing ),以确定该化学物(或混合物)是否具有干扰生物机体内分泌活性的作用,即是否属于内分泌干扰物?这对于制定保护生态环境和人类健康的预防措施和决策具有重要意义。在环境内分泌干扰物的甄别方法研究中,目前尤其应注意的是:(1)随着研究的不断深入和扩大,EEDCs 的作用已不仅仅局限于由激素受体介导的对激素功能的激活或阻遏,还应当包括对整个内分泌腺轴内稳态的破坏,以及对激素的产生、分泌、合成、代谢、转运和排泄等过程的干扰等。因此用“环境激素”或“环境类激素”来代表整个这一类化学物就显得不够准确;(2)在目前对动物实验要求实施三

“R ”

(refine/replace/reduce )呼声很高的环境氛围中,如何建立我们自己的、可靠和实用的环境内分泌干扰物甄别方法和评价体系。

一、环境内分泌干扰物甄别方法的范围

环境化学物内分泌干扰活性的甄别是指应用科学的方法来鉴定某种化学物是否具有EEDCs 的各类效应特征,以确定该化学物是否属于EEDCs 。这是识别、研究和控制EEDCs 污染和保障人类健康的前提,也是目前EEDCs 研究中最急需解决的问题。环境内分泌干扰物的甄别和评价方法目前至少应包括以下几方面:(1)环境化学物模拟或拮抗生物体内主要激素如雌激素、雄激素、甲状腺素活性的甄别和评价方法;(2)环境化学物对生物体内上述激素的产生、分泌、转运、代谢、排泄等活动过程干扰的甄别和评价方法;(3)环境内分泌干扰物对人类健康

整体效应(尤其是下丘脑-垂体-腺轴)的评价方法;(4)环境内分泌干扰物的生态效应评价方法;(5)多种环境化学物(混合物)内分泌干扰活性(联合

作用)的评价方法。

目前人类所接触的环境化学物种类仍在不断增加,其中较重要的有农药和兽药(包括活性组分和非活性组分)、化肥、工业化合物、药物、化妆品、食品添加剂和营养补充剂、其他环境和食品污染物等。在这些化学物中,已对其内分泌干扰活性作过初步评价者仅占少数,做过较全面的评价者更属凤毛麟角。因此,对数量庞大的环境化学物的内分泌干扰活性进行甄别和评价,工作量是极其巨大的,发展快速和可靠的甄别和评价方法,其意义也是不言而喻的。

二、目前美国和欧共体采用的甄别方法及评价体系

快速、灵敏、经济的甄别方法是鉴别、评价和研究EEDCs 的前提条件。因此,美国和欧共体等发达国家十分重视发展对环境内分泌干扰物的甄别方法。目前主要是发展快速、简易、经济、可靠且适合批量、低浓度的甄别方法,如甄别雌激素干扰化学物的酵母雌激素甄别法、雌激素受体竞争抑制法、卵黄蛋白原法及芳香化酶抑制剂甄别法等。甲状腺素干扰物的甄别方法近年来也有较快发展。

11美国国会1996年通过两项立法(食品质量

保护法和安全饮水法),敦促美国环境保护局(EPA )加强内分泌干扰物的甄别方法研究。

21EPA 提出的环境内分泌干扰物甄别方法体

系:包括第一层次的筛选(T1S )和第二层次的实验(T2T )。

(1)第一层次的筛选(tier 1screening ,T1S ):T1S 作为初筛实验,可判定某化学物或混合物属于:

①可能的雌、雄激素或甲状腺激素干扰物,从而进入T2T 实验组;②不是EEDCs 或可能性很小,除非在

特殊情况下才进入T2T 。即T1S 的目的是判定某

化学物不是(或很可能不是)EEDCs或可能是EEDCs。T1S必须具备:①灵敏度高,以减少假阴性;②足以反映体内的代谢活动;③覆盖已知的EEDCs作用的所有领域;④在生物分类学上覆盖面广;⑤有足够的多样性,以通过权衡结果得出结论;

⑥快速、经济。

T1S包括体外和体内两大类分析方法。体外分析方法包括雌激素受体结合或报告基因实验、雄激素受体结合或报告基因实验及睾丸碎屑类固醇合成实验(steroidogenesis assay with minced testis)等。体内分析方法包括啮齿类动物3d子宫营养实验、啮齿类动物5～7d Hershberger实验(雄激素)、啮齿类动物20d青春期雌性实验(甲状腺终点)、蛙变态实验及鱼类生殖筛选实验等。

T1S的选择实验有胎盘芳香酶实验、啮齿类动物20d青春期雄性甲状腺终点实验、改进的啮齿类动物3d子宫发育筛选实验(腹膜内给药)及啮齿类14d未经阉割的成年雄性甲状腺终点实验等。

有待发展的筛选方法有子宫发育筛选实验、鸟类雄激素实验、海龟类卵实验(内分泌终点)、鱼类、鸟类卵巢发育实验及无脊椎动物筛选实验等。

(2)第二层次的实验(tier2testing,T2T):其目的是确定内分泌干扰作用的性质、可能性和剂量-反应关系。由于T1S存在假阳性等缺点,故T2T是对T1S的补充,但T2T所需时间较长。

现有的T2T方法包括:两代哺乳动物生殖毒性研究(内分泌终点)、两代鸟类生殖毒性研究(内分泌终点)、两代鱼类生殖毒性研究(内分泌终点)或生活周期毒性实验、两代虾(mysidacea)生殖毒性研究(内分泌终点)或其他无脊椎动物生活周期毒性实验及两栖类发育和生殖实验等。

有待发展的T2T方法有:一代哺乳动物生殖毒性研究(内分泌终点)、替代的哺乳动物生殖毒性研究及爬行类动物生殖毒性研究等。

对于甲状腺干扰物的甄别方法,目前主要是测定暴露后啮齿动物的血清甲状腺素(T4)和促甲状腺素(TSH)浓度(初筛),同时进行甲状腺组织学评价。此外,对于增加TSH水平的干扰物可通过检测甲状腺细胞的核增殖抗原(PCNA)来甄别;对于降低TSH反应的干扰物可通过生理性、病理性的甲状腺素受体结合实验来甄别;对于促进T4代谢和清除的干扰物可通过药代动力学实验来甄别;对于与甲状腺球蛋白、运载蛋白竞争结合的干扰物可通过体外竞争性结合实验来加以甄别。此外,还有甲状腺过氧化酶分析法、GH3细胞分析法及蝌蚪变态分析法等。

3.体内和体外实验的优缺点比较:从已提出的甄别方法来看,可分为体内和体外实验两大类。由于化学物在体内产生内分泌干扰效应常常要受多方面因素的影响,如外来化学物在体内的代谢、转化、转运、分布和排泄;在体内与激素受体的亲和力;化学物对体内激素受体的激活能力等。故整体动物的体内实验结果具有相对的准确性和权威性。但体内方法耗资、耗时、耗力,不适用于批量测试和现场应用,特别是在环境低浓度暴露的情况下,常不易获得正确反应。因此,虽然体内方法目前仍被认为最具有确认EEDCs的权威性,但快速、简易、经济、可靠的体外甄别方法仍然是研究与发展的主要方向。

4.美国EPA根据“内分泌干扰物甄别顾问委员会(EDSTAC)”的建议,将估计所需测试的物质(87700种)分为4类。第一类为已有确切的论据证明无内分泌干扰效应,属于这一类的化学物有强酸强碱、氨基酸、糖类及某些聚合体(平均相对分子质量大于1000,不易跨过生物膜和生物屏障而引起内分泌效应)等。第二类为目前掌握资料尚不充分的化学物,它们将首先进入第一层次(T1S)筛选实验,亦可应用“高通量”的前筛选实验(HTPS)等,然后再进入第二层次(T2T)测试及危害性评价。第三类为掌握资料已较充分的化学物,可以绕过第一层次(T1S)筛选实验而直接进入第二层次(T2T)测试然后进入危害性评价。第四类是已有充足资料可用于危害性评价,而无需再进行甄别的化学物。

三、目前已发展的EEDCs甄别方法的缺陷

11目前已发展的EEDCs甄别方法主要集中在模拟或干扰雌激素和甲状腺素活性的甄别,仅有少量的干扰其他激素(如雄激素、肾上腺皮质激素等)活性的甄别方法研究。

21甄别方法的实用性主要取决于其特异性、敏感性、反应时间、简便性和经济性。目前大多数甄别方法的敏感性较低而特异性偏高,耗时耗费用较多,不适用于大范围的筛选。

31在多种EEDCs联合作用的内分泌干扰效应以及对人类健康的综合效应方面的研究还极为少见。

四、EPA关于EEDCs甄别方法体系的发展战略