猪瘟病毒E2基因活载体疫苗研究进展_王青

动物医学进展,2010,31(7):98-102

Progress in Veterinary Medicine

猪瘟病毒E2基因活载体疫苗研究进展

王　青,胡建和＊,郑素玲,吴玉苹

(河南科技学院,河南新乡453003)

摘　要:猪瘟病毒(CSFV)E2囊膜蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原蛋白,也是研究猪瘟基因工程疫苗的首选抗原。常用的猪瘟病毒E2基因活载体主要有腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、伪狂犬病病毒载体、杆状病毒载体等,且每种病毒载体各有其优势特点。国际上应用病毒载体已成功研制出猪瘟新型疫苗并应用于临床。论文主要介绍了目前常用的病毒载体,并分别列举了使用这些表达载体进行猪瘟基因工程疫苗研究的进展情况。

关键字:猪瘟病毒;E2基因;病毒表达载体

中图分类号:S852.651文献标识码:A文章编号:1007-5038(2010)07-0098-05

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,严重威胁着我国的养猪业,同时也给世界的养猪业造成了巨大的经济损失[1]。CSFV属于黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(P estivirus),其基因组为线状单股正链RNA,约12.3kb,其基因组含有单一的开放阅读框(open reading frame,ORF),从5′端到3′端,CSFV的ORF可顺次翻译衣壳蛋白C和

收稿日期:2009-10-07

基金项目:河南省高校杰出科研人才创新工程项目(2006K YCX020)

作者简介:王　青(1978-),女,河南社旗人,助理实验师,硕士,主要从事分子病原学与免疫学研究。＊通讯作者

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Progress on Pulse Electric Field Sterilization Technology and Its Application

ZH OU Ji-zhang,GONG Xiao-w ei

(S ta te Key Laboratory o f Veter inar y Etiolo gical B iolog y,Key Laborator y of Veter inar y Public Hea lth o f Ministr y o f Ag ricu lture, Lanz hou Veter inar y Research Institute,Ch inese Acad emy o f A gr icultur al S ciences,Lanz hou,Gansu,730046,China)

A bstract:The pulse electric field sterilization techno logy is a transient v oltage change in the use of w hich leads to irreversible lo ss of bacteria,w hich leads to the death of a non-thermal sterilization techno logy. This pape r summ arized the ste rilization mechanism,characteristics,sterilizatio n effect and the research pro gress of its application.The hig h voltage pulsed electric field co uld replace the traditional m ethods fo r chemical reagents to inactiv ate pathogens.This technolo gy is an innov ation in the filed of killing patho gens and preparing inactiv ated vaccine.

Key words:pulsed electric field;pathog en;inactivatio n

DOI:10.16437/ ki.1007-5038.2010.07.017

囊膜糖蛋白E rns、E1、E2等4种结构蛋白以及7种非结构蛋白。其中E2囊膜糖蛋白由373个氨基酸残基组成,是CSFV诱导产生保护性中和抗体的主要抗原结构蛋白,针对E2囊膜糖蛋白的研究成为攻克CSF的热点[2-3]。

在研究CSFV基因工程疫苗的各种表达系统中,最早应用的是原核表达系统。原核表达系统的优点是能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但原核表达系统还存在许多难以克服的缺点,如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控;有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。为了克服原核表达系统的诸多缺点,研究者开始使用病毒表达系统进行研究。通过使用病毒载体不仅可以诱导E2基因高效真核表达,还可以有效控制基因的表达量,避免基因的非特异性激活或抑制等[4-6]。目前应用于CSFV E2基因研究的病毒表达载体主要有腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体等。

1　腺病毒载体

1.1　腺病毒载体的一般特征

腺病毒载体(Adenovirus vector,Adv)基因组是一个线性的双链DNA,其5′端与一种末端蛋白(ter-minal pro tein,TP)共价结合,5′端上还具有末端反向重复序列(long terminal repeat sequence,LT Rs)。腺病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶,这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需的。在腺病毒基因组中E1区为腺病毒复制必需区,它的缺失使腺病毒载体成为复制缺陷型载体。E3区是病毒复制非必需区,可用于外源基因的插入。腺病毒载体常见的构建方法是:将启动子外源基因PolyA盒插入到E1缺失区,构建成穿梭质粒载体;然后将E3区缺失的腺病毒DNA末端连成环状(内有细菌质粒的复制原片段),此时环状腺病毒DNA可以在细菌内复制,但不会被包装成病毒体。载有外源目的基因的穿梭质粒与环状病毒质粒共转染293细胞(人胚肾细胞),通过同源重组可以产生一个E1区域缺失的带外源基因的腺病毒重组体。293细胞是由腺病毒左末端片段整合到人胚肾细胞培养而成,因此293细胞可以持久地分泌产生腺病毒E1蛋白,激活同源重组体产生包装蛋白,通过反式互补即可产生复制缺陷的重组腺病毒[7-8]。Adv具有宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、易纯化、外源基因装载容量大等优点,越来越广泛地被应用于基因工程疫苗研究。

1.2　腺病毒载体在猪瘟病毒E2基因研究上的应用

腺病毒载体在体外具有高效地传递和表达基因的能力,在近几年内已经得到充分证实和记载。

H ammo nd J M等[9]将CSFV Wey brdge株的E2基因插入Adv基因组中,置于主要晚期启动子的调控之下,成功构建了含E2基因的重组腺病毒A dv-gp55,并用其进行动物试验,一次接种就能使猪得到良好的免疫效果,免疫后攻毒可得到100%的保护,剖检无病变。孙永科等[10]利用腺病毒载体成功构建了CSFV石门株E0基因的重组腺病毒Adv-E0、表达CSFV石门株E2基因的重组腺病毒Adv-E2和联合表达CSFV石门株E0-E2基因的重组腺病毒A dv-E0-E2,并且进行了免疫保护试验,结果发现仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离;而含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。孙元等[11]利用腺病毒为载体构建猪瘟腺病毒活载体疫苗的研究也取得了很好的效果,目前已进入疫苗开发程序。这些研究成果为猪瘟腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。

2　逆转录病毒载体

2.1　逆转录病毒载体的一般特征

逆转录病毒(Retroviruses)是一类动物RNA病毒。其基因组是由2条相同的单链RNA分子组成,此外,在病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、反转录酶和整合酶等组分[11]。目前,在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种逆转录病毒,但其中研究最为详尽的是劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)。逆转录病毒有以下几个特点:①逆转录病毒的肿瘤基因(oncogene,ONC)能够在细胞中转录。这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子,根据这种特性,可以在正常细胞中进行操作,将它改建为有用的动物基因转移载体。②逆转录病毒的寄主范围相当广泛,包括无脊椎动物,有的还能够在人体细胞中生长。③逆转录病毒不但感染效率高,而且通常不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代,保持正常生长和保持病毒感染性的能力。④在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题[12]。逆转录病毒表达系统的研究开发和应用,为获得高效、稳定表达外源蛋白的基因工程细胞系提供了新的有效技术途径[13]。因此,可以利用逆转录病毒的这些优点,构建以逆转录病毒为载体的基

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